体外释放酶免疫技术检测结核分枝杆菌的临床应用

汪金云，周东枝，徐亚丽

体外释放酶免疫技术检测结核分枝杆菌的临床应用

汪金云，周东枝，徐亚丽

目的 评价体外释放酶免疫技术在检测结核分枝杆菌中的临床应用。方法 选择临床病例201例包括肺内结核81例、肺外结核25例、不明原因发热95例（其中45例为肺结核），另选健康人群30例，采用体外释放酶免疫技术（TB-IGRA）、胶体金法（TB-Ab）、痰涂片抗酸染色镜检及聚合酶链式反应（TB-PCR）检测。结果 TBIGRA检测肺内结核组、肺外结核组以及不明原因发热组的阳性率明显高于其他检测组，4种检测方法在肺内结核组、肺外结核组、不明原因发热组与健康对照组间差异均有统计学意义（均＜0.05）；TB-IGRA、TB-AB、痰涂片镜检、TB-PCR的灵敏度分别为91.4%、43.1%、30.9%、23.8%，特异度分别为91.3%、90.0%、98.7%、97.5%；126例肺结核患者中，痰涂片39例阳性和87例阴性，TB-IGRA检测阳性率分别为92.3%、83.9%，两者差异有统计学意义（＜0.05）。结论 TB-IGRA有更好的优越性和临床应用，可推广用于临床。

结核分枝杆菌；体外释放酶联免疫法；-干扰素

结核病是由结核分枝杆菌所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病，是造成人类死亡最多的疾病之一。据统计我国结核病年发病100万，发病率78/10万，全国现有活动性肺结核患者499万，患病率119/10万，结核病年死亡人数5.4万，死亡率4.1/10万[1]。所以早期诊断和合理用药对结核病患者尤为重要。目前临床普遍采用的结核病诊断主要依赖于临床症状、影像学特征和病原学诊断。至今没有一种准确、快速、可靠检测结核分枝杆菌的方法[2]。本文比较几种实验室检测结核分支杆菌感染的方法，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集浙江省宁海县第一医院2013年1月至2014年4月收治的结核分枝杆菌疑似病例201例，其中男135例，女66例；年龄16～65岁；经临床确诊肺内结核81例，肺外结核25例，不明原因发热就诊病例95例。另选本院健康体检职工30例，设为健康对照组，其中男16例，女14例；年龄25～55岁。

1.2 仪器和设备 北京万泰生物有限公司体外释放酶免疫技术（TB-IGRA）试剂盒；杭州艾博生物有限公司胶体金法（TB-Ab）试剂盒；中山大学达安生物有限公司聚合酶链式反应（TB-PCR）试剂盒；上海科华KHB ST-360酶标仪；美国ABI PRISM 7000型荧光定量基因扩增分析仪；德国徕卡DM500普通光学显微镜、离心机、水浴箱等。

1.3 方法 空腹采集静脉血5 ml，一管肝素锂抗凝管和一管生化管，分别用TBIGRA和TB-Ab；再采集2份痰标本分别用于痰涂片抗酸染色镜检和TB-PCR，标本采集严格按照实验室标本采集规范要求。TB-IGRA采用体外释放酶免疫技术检测结核分枝杆菌，采集静脉血分3 管24 h培养，再应用酶联免疫吸附技术（Elisa）检测，间接判断结核分枝杆菌的感染，具体操作方法和结果判断严格按照试剂盒说明书。TB-AB用胶体金技术检测血清结核抗体，具体操作方法和结果判断严格按照试剂盒说明书；痰涂片用抗酸染色镜检找抗酸分枝杆菌，由资深专业人员进行检测；TB-PCR用PCR体外扩增技术检测痰标本中结核分枝杆菌DNA，具体操作方法和结果判断严格按照试剂盒说明书。

1.4 统计方法 采用SPSS 19.0统计软件进行处理，计数资料比较采用2检验。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同对象组 4种检测方法的检测结果 TB-IGRA检测肺内结核、肺外结核、不明原因发热阳性率明显高于其他检测方法（均＜0.05），其中肺外结核组痰涂片和 TB-PCR由于未收集到标本，未检测。见表1。

表1 不同对象组4种检测方法的检测结果 例（%）

2.2 95例不明原因发热4种检测方法检测结果 不明原因发热95例患者经临床确诊为肺结核45例，非结核杆菌感染50例。肺结核组TB-IGRA检测方法阳性率明显高于其他3种方法（＜0.05），而非结核组4种检测方法间差异无统计学意义（＞0.05）。见表2。

表2 不明原因发热95例4种检测方法检测结果 例（%）

2.3 不同方法的灵敏度和特异度比较TB-IGRA灵敏度明显高于其他3种方法，4种方法特异度相差不大。见表3。

表3 4种方法的灵敏度和特异度 %

2.4 痰涂片阳性与阴性肺结核患者TBIGRA结果比较 在126例肺结核患者中，痰涂片结核杆菌39例阳性同时用TB-IGRA检测36例阳性（92.3%），而痰涂片87例阴性同时用TB-IGRA检测73例阴性（83.9%），两者差异有统计学意义（2=80.2，＜0.05）。

3 讨论

目前结核分枝杆菌感染实验室检测主要依赖病原体检测，随着免疫学技术快速发展，体外释放酶联免疫法是利用致病性结核分枝杆菌特有而卡介苗、其他分枝杆菌缺失的开放读码框区域 1 （RD1）基因编码的早期分泌靶向抗原6-kD（ESAT-6）和培养滤过蛋白 10kD （CFP10）肽段库为抗原刺激全血标本中结核抗原特异性T细胞产生免疫应答，诱发结核感染T细胞分泌 -干扰素，再通过 ELESA方法检测计算 -干扰素的含量，间接判断结核分枝杆菌感染状况。本文结果显示，TB-IGRA在肺内和肺外结核阳性率和灵敏度，明显高于其他3种方法，其对诊断肺结核肺外结核具有较高的敏感性和准确性。通过检测 -干扰素含量可以判断患者病程进展和体内细菌含量，还可以作为病情治疗疗效的一个指标，这已在Prabhu Anand[3]及方颜敏等[4]的实验著作中得到了证实。特别在对一些不明原因发热的患者 TB-IGRA阳性率也明显高于其他3种方法，可以用于一些不明原因发热患者的早期筛查，如果TB-IGRA结果阳性，可进一步有针对性检查，提高结核菌检测的阳性率。对痰涂片39例阳性和87例阴性肺结核患者TB-IGRA的阳性率差异有统计学意义（＜0.05），说明TB-IGRA也可用于痰涂片阴性结核病的诊断。而血清结核抗体灵敏度只有43.1%，血清结核抗体检测主要以分枝杆菌外膜抗原为包被抗原，其他分枝杆菌感染也呈阳性，这样给检测带来干扰。

病原体检测是诊断结核分枝杆菌感染的“金标准”，但是其阳性率普遍都较低，文献报道痰涂片和痰细菌培养的阳性率约为40%[5]。本文痰涂片镜检和TBPCR在肺内结核阳性率也是只有32.1%、24.7%，灵敏度为30.9%、23.8%，和文献报道相差不大。病原体的检测标本采集十分重要，不合格标本大大降低其阳性率，镜检、痰培养、TB-PCR检测对人员和环境要求较高，且检测耗时长。综上所述，病原体检测是诊断结核分枝杆菌感染的“金标准”，但检出率低，血清结核抗体检测阳性率也不高且干扰大。

而TB-IGRA作为结核杆菌感染诊断有效方法，特别是早期不明原因发热临床症状不明显，可用其作早期筛查指标，且检测耗时短，便于操作，可用于临床。

[1] 2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查[J].中国防痨杂志,2012,8(34): 485-508.

[2] Garg SK,Tiwari D.Diagnosis of act ive tubercul osis:availablet echnologies,limit at ions,an d pos sibilities[J].J Clin Lab Anal,2003,17:155-163.

[3] Prabhu Anand S,Harishankar M,Salvaraj P,et al.Interferon gammagne+874 APT polymorphism and intercellular interferon gamma expression in pulmonary tubercul-osis[J].Cytokine,2010,49(2):130-133.

[4] 方颜敏,马志明,柯桥,等.肺结核病灶组织中C-干扰素的表达及其临床意义[J].实用医学杂志,2010,26(13):2328-2330.

[5] Drobniewski FA,Caws M,Gibson A,et al.Modern laboratory diagnosis of tuberculosis[J].Lancet Infect Dis,2003,3(3): 141-147.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.016

R446.5

A

1671-0800(2016)01-0032-02

2015-08-10（本文编辑：孙海儿）

315600浙江省宁海，宁海县第一医院

汪金云，Email:23752847@ qq.com