脂肪酶水解椰子油动力学研究

武林贺，白新鹏，吴谦，徐小梦，马若影，李雪（海南大学食品学院，海南海口570228）

脂肪酶水解椰子油动力学研究

武林贺，白新鹏*，吴谦，徐小梦，马若影，李雪
（海南大学食品学院，海南海口570228）

椰子油；脂肪酶；水解；动力学

脂肪酶催化油脂水解生成油脂衍生物是一种高效、环保、低能耗的方法［1-2］，它是以酶作催化剂的酶解反应，这种反应是在温和的条件下进行的，不会产生传统的油脂水解产物颜色深、发生热聚合等现象，而且具有选择性，反应过程中不会发生腐败变质等现象，获得的产物质量较好，因此脂肪酶水解油脂的技术应用逐渐广泛［3-4］。椰子油［5-7］富含多种饱和脂肪酸甘油酯，椰子油衍生物是由椰子油水解产生的［8-9］，其中月桂酸等饱和脂肪酸多用于食品和日用品领域，而且需求量日渐增大［10-11］。目前主要是用天然植物油脂皂化分离、高温高压分解和合成脂肪酸等方法生产月桂酸等饱和脂肪酸。这些方法不但成本较高，而且在生产中会出现脂肪酸的氧化分解、产品颜色较深等现象［12-13］。在国外利用脂肪酶水解油脂生产油脂衍生物的方法已经应用到生产实践当中，美国和意大利已经利用脂肪酶水解牛油和亚麻油来生产脂肪酸，其生产成本低，得到的脂肪酸的质量较好［14］。而我国使用脂肪酶水解油脂的技术起步较晚，尤其是脂肪酶水解椰子油

1　材料与方法

1.1材料

海南本地高种椰子；脂肪酶（20万U/g）、纤维素酶（20万U/g）、木瓜蛋白酶（20万U/g）、β-葡聚糖酶（36万U/g）：购自北京梦怡生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Anke（GL21GII）高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；Re（52）旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZD（III）真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；HR（1724）型打浆机：珠海飞利浦家电公司；SHZ（B）恒温水浴振荡器：上海龙跃仪器有限公司；SHA（2）恒温振荡器：常州澳华仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1椰子油的制备

采用水酶法制备椰子油，其工艺为采果、去椰衣、去种皮、打浆、酶解、灭酶、离心及干燥。将新鲜的椰子去椰衣和种皮后的椰肉破碎打浆，加入适量的水调节料液比，加入一定量的水解酶在一定的温度下酶解一定的时间后进行离心分离，将分离出的油脂部分进行精炼处理得到椰子油。

1.3.2椰子油酸值的测定

将椰子油与水按一定比例混合，水浴加热到反应所需温度，快速加入一定量脂肪酶，用玻璃棒搅拌均匀后放入恒温水浴振荡器开始反应。为保证反应温度恒定，每次取样要少量快速。反应后的样品经离心分离、干燥后，测定其酸值的变化。

1.3.3酶解动力学的研究

1.3.3.1不同单因素条件对酶解速率的影响

研究底物质量浓度、酶添加量、酶解温度和酶解时间对脂肪酶水解椰子油的影响。试验条件为底物质量浓度、酶添加量、酶解温度和酶解时间，在其它条件不变的情况下，分别改变酶解时间（20、40、60、80、100、120 min）、酶解温度（45、50、55、60、65℃）、酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）和底物质量浓度［0.2、0.4、0.6、0.8、1.0（g/mL）］，按1.3.2的方法进行酶解试验，测定酶解后的原生态椰子油的水解率，按照式（1）计算酸值变化速率，即反应速率v［mg/（g·mL·min）］：

式中：A为酸值，mg/g；V为反应体积，mL；t为反应时间，min。

1.3.3.2酶解动力学模型的建立

Michaelis-Menten对酶解反应做了两步假设，即酶与底物的酶促反应按下面反应步骤进行：

式中：k1为ES生成的反应速率常数；k2和k3分别代表ES分解为E+P和E+S的反应速率常数；k4为E+ P生成ES的反应速率常数。

首先，脂肪酶（E）与反应底物（S）结合成反应中间产物（ES），然后反应中间产物分解成产物（P）后，脂肪酶被释放出来。在反应开始阶段，如果产物（P）的浓度较低或没有产物（P）的反应体系中，可逆反应是不能发生的，因此k4过程可以忽略，第二步的反应就可以看作是单向反应，即可得出酶解反应的动力学方程：

式中：［S］为底物质量浓度，g/mL；［E］total/（g/mL）＝［E］＋［ES］；［ES］为中间产物，g/mL。令km=（k2+k3）/k1，vm=k2［E］total，则方程（3）可简化为：

方程（4）即为米氏方程，其中km［mg/（g·mL）］为米氏常数；Vm［mg/（g·mL·min）］为最大反应速率。将米氏方程进行变形，即可得到方程（5）：

1.3.4分析方法

酸值按GB/T 5009.37-2003《食用植物油卫生标准的分析方法》测定。

1.3.5数据处理方法

每组试验分别进行3次独立的重复试验，用spss19.0 for Windows软件对数据进行方差分析，并用Duncan法进行多重比较。

2　结果与分析

2.1酶解时间对椰子油酸值的影响

酶解时间是脂肪酶酶解油脂的主要影响因素。图1显示了酶解时间对椰子油酸值影响。

图1　酶解时间对椰子油酸值的影响Fig.1　Effects of enzymolysis time on acid value

在一定的条件下，脂肪酶能够结合在油脂的特定部位水解油脂，随着酶解时间的增加椰子油不断被脂肪酶水解，油脂中甘油一酯、甘油二酯和脂肪酸的含量逐渐增加，从而使脂肪酶可利用的底物浓度降低，导致反应速率不断下降，最终使得反应速率基本保持恒定。从图1可知，酶解反应60 min最为适宜。

2.2温度对椰子油水解速率的影响

图2为温度对椰子油酶解速率的影响。

图2　温度对椰子油水解速率的影响Fig.2　Effect of temperature on hydrolysis rate of coconut oil

由图2可知，随温度不断升高，椰子油的酸值变化速率逐渐增大，50℃时酸值变化速率最大，50℃以后，反应速率迅速下降。随着温度的升高，首先达到酶反应的最适温度，使得反应速率达到最大；但是当温度继续升高时，脂肪酶会因温度的升高逐渐失活，从而导致酶促反应速度迅速下降。

2.3酶添加量对椰子油水解速率的影响

图3为酶添加量对椰子油酶解速率的影响。

由图3可知，在反应的起始阶段，当脂肪酶添加量逐渐增加时，反应速率也随之增大，反应速率和酶添加量几乎呈线性关系变化。在反应体系中如果底物比较充足，随着酶添加量的增加，反应速率也随之增大；当酶添加量继续增加时，此时反应底物不能满足酶的需求，反应速率开始减小，并逐渐变慢。本试验是在底物充足的条件下进行的，因此，酶添加量与酸值的变化速率几乎呈现线型的规律变化。

图3　酶添加量对椰子油水解速率的影响Fig.3　Effect of enzyme concentration on hydrolysis rate of coconut oil

2.4底物质量浓度对椰子油酶解速率的影响

图4为底物质量浓度对椰子油酶解速率的影响。

图4　底物质量浓度对椰子油水解速率的影响Fig.4　Effect of substrate concentration on hydrolysis rate of coconut oil

由图4可知，当酶添加量一定时，酶解反应速率随着底物质量浓度的增加，酶解速率先增大然后趋于平缓。反应刚开始，反应体系中底物质量的浓度较低，水解速率较快，反应速率基本成线性增加；当继续增加底物质量浓度时，水解速率逐渐变得平缓，这可能是由于酶几乎全部与底物结合，此时反应的速率和底物的浓度基本无关。图4显示了［S］与v的关系，两者符合典型的双曲线关系，符合米氏方程酶促反应特征的，因此可以采用米氏方程对试验数据进行拟合，求得动力学模型。

2.5动力学研究

2.5.1Lineweaver-Burk双倒数法求解方程参数

图5Lineweaver-Burk双倒数法作图Fig.5　Lineweaver-Burk plot

方程的相关系数R2＝0.991 2，方程极显著。

2.5.2Wilkinson法求解酶解方程参数

Wilkinson统计法是研究动力学的一种方法，一般应用于酶解反应动力学的研究中，研究方法可靠，但是计算过程复杂。它有两步计算，第一步是最小二乘法求估算解，求得估算值，在估算值的基础上再利用泰勒展开式求精校解，得出动力学的模型。Wilkinson统计法求估算解见表1，Wilkinson统计法求精校解见表2。

表1为最小二乘法求估算解。由表1可知，△= αε-γδ=0.000 84

式中：Vm0、km0分别为最大反应速率和米氏常数的估算解。

表2泰勒展开式求精校解。由表2可得到，

式中：a1、a2分别为Vm、km计算修正系数。

最后可得到精校解为：Vm=Vm0a1=0.969 6［mg/（g· mL·min）］；km=km0+a2/a1=1.273 9［mg/（g·mL）］。

2.5.3Lineweaver-Buck和Wilkinson的比较

对于Lineweaver-Buck法而言，计算过程简单，用于质量浓度在0.33 km～2.0 km反应体系统较为精确；而Wilkinson统计法可用于动力学的分析计算研究中，计算结果比较精确，但是其分析计算过程比较复杂。因此本试验又做了Wilkinson统计法校正，求出经过精确校正后的Vm=0.969 6［mg/（g·mL·min）］，km= 1.273 9［mg/（g·mL）］。即得脂肪酶水解椰子油的米氏方程：

表1　Wilkinson统计法求估算解Table 1　Calculation of provisional values by Wilkinson method

表2　Wilkinson统计法求精校解Table 2　Fine adjustment of values by Wilkinson method

2.5.4椰子油酶解动力学验证试验

取不同质量浓度的椰子油反应体系，在酶添加量为1%、酶解温度50℃条件下进行验证试验，对比两种计算方法可以得到的脂肪酶酶解椰子油的动力学方程的理论值和实测值，然后对方程进行验证，以确定方程的准确性和可靠性，见图6。

图6 酶解动力学验证试验Fig.6　Validation of the developed hydrolysis kinetic model

由图6可知，底物质量浓度在0～0.6 g/mL范围内，可采用Lineweaver-Buck法计算反应速率，计算得到的值与实际值比较接近；当底物质量浓度大于0.6 g/mL，使用Wilkinson统计法计算得到的计算值与真实值比较接近。而本试验中的底物质量浓度为0.6 g/mL，Wilkinson统计法可进行方程的求解。而本试验米氏方程的拟合度较高，因此米氏方程也适合脂肪酶水解椰子油的动力学研究。

3　结论

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Kinetic Modeling of Enzymatic Hydrolysis of Coconut Oil with Lipase

WU Lin-he，BAI Xin-peng*，WU Qian，XU Xiao-meng，MA Ruo-ying，LI Xue
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

coconut oil；lipase；hydrolysis；enzymatic kinetics

2012-05-09

国家自然科学基金地区科学基金项目（31160325）；海南省自然科学基金（20153159）；海南省自然科学基金（314075）；海南省高等学校科研项目（Hnky2016ZD-1）

武林贺（1988—），男（汉），在读硕士研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

白新鹏（1963—），男，教授，博士。的研究鲜见报道。因此利用脂肪酶水解椰子油来生产其衍生物的研究具有重要意义。本文对脂肪酶水解椰子油的动力学过程进行了研究，考察了底物的质量浓度、酶添加量、酶解温度和酶解时间等工艺条件对椰子油水解速率的影响，建立动力学模型，以期为今后产业化开发椰子油衍生物产品提供理论模型［15］。