新疆塔城地区哈萨克族传统奶酪中酵母菌的分离鉴定

芦文娟，李宝坤，卢士玲

新疆塔城地区哈萨克族传统奶酪中酵母菌的分离鉴定

芦文娟，李宝坤*，卢士玲

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

为保护新疆哈萨克族传统奶酪中的优良酵母菌株，从新疆塔城牧区不同牧场采集的10份哈萨克族传统奶酪样品中，分离得到44株酵母菌。采用形态学、生理生化特性鉴定、5.8SrDNA序列同源性分析相结合的方法，对分离菌株进行鉴定。共鉴定出5个种，其中34株库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii），为优势菌株，6株戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii），2株乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），1株马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus），1株发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）。结果表明，哈萨克族传统奶酪制品中所含酵母菌与其他地区的存在差异性，有其独特的酵母菌资源。

奶酪；奶酪；酵母菌；分离鉴定

新疆属温带大陆性干旱气候，年温差与日温差极大，在降水和气温方面，地区的差异也非常显著［1］，新疆也是中国四大牧场之一，世代生存游牧民族，有很多的少数民族，他们一直保留着自制并食用传统发酵乳制品的习惯，使得新疆传统发酵乳制品具有鲜明的地域特点。奶酪就是各族少数民族非常喜欢食用一类自制发酵乳制品。奶酪具有独特的风味，不仅能够增强人体的抵抗力，还能够促进机体新陈代谢，增强活力；胆固醇含量较低，对心血管健康有一定的益处；同时奶酪还是含钙最多的奶制品，这些钙类也较易被吸收［2］。当地居民沿用古老而传统的方法生产发酵奶酪，这种原生态的制作方法，较好地保留了发酵乳制品的风味，富含了当地自然环境中的丰富的微生物资源，营养价值高，并具有较好的益生作用［3］。
但随着工业化的发展，游牧生活日渐减少，这种传统发酵乳制品的制作也随之减少，其中富含的丰富微生物资源面临丢失的困境。近几年，许多学者对新疆传统发酵乳制品中的微生物进行了研究，但传统发酵乳制品中对酵母菌种的研究相对乳酸菌还非常少，并且由于所采样品地区和民族之间的差异，使分离得到的微生物种类和数量存在较大的差异性［4］。

本研究以新疆塔城牧区哈萨克族传统奶酪为原料，采用形态学、生理生化特性、5.8S rDNA序列同源性分析相结合的方法对分离菌株进行鉴定，并对奶酪中酵母菌的分布和种类的多样性进行分析。不仅能够系统地收集和保存新疆塔城牧区哈萨克族传统奶酪中的酵母菌，丰富我国的酵母菌资源；也有利于更加深入准确地了解酵母菌种资源在传统发酵乳制品中的分布。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1样品来源

新疆哈萨克族奶酪：采自新疆塔城喀拉也木勒、乌宗布拉克、二道桥等10个牧场。

1.1.2培养基［5］

菌种的分离使用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，纯化和保存使用酵母膏胨葡萄糖琼脂（yeast extract peptone dextrose，YEPD）平板和斜面培养基。

鉴定用培养基使用Gorodkowa琼脂培养基、氮源基础培养基、碳源基础培养基、糖发酵基础培养基、产酸基础培养基、产酯基础培养基、产类淀粉培养基。

1.1.3主要试剂

酵母菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、2xTaq PCR MasterMix：天根生化科技有限公司；GoldView核酸染色剂：北京索莱宝科技有限公司；引物ITS1和ITS4：上海生工生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

W-CJ-1Cg超净工作台：苏州净化设备有限公司；DNP-9272电热恒温培养箱：上海精宏试验设备公司；5417R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；LD2X-30KA立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；COVER-015普通光学显微镜：日本OLYMPUS公司；TC-512聚合酶链反应（polymerase chainreaction，PCR）扩增仪：美国Techne公司。

1.3实验方法

1.3.1酵母菌的分离与纯化

取1 g奶酪样品，溶于9 mL无菌水中，采取稀释平板法涂于PDA培养基进行分离，平板置于25℃培养箱中培养36～48 h，观察并记录菌落特征，挑取不同形态单个菌落，进行简单染色，观察细胞形态，重复几次纯化酵母菌，直至镜检结果为同一细胞形态后，将其接种于YEPD固体斜面培养基上，25℃培养36～48 h后，于4℃保存备用。

1.3.2酵母菌的生理生化特性鉴定

酵母菌分离菌株主要通过繁殖方式观察、子囊孢子形成实验、掷孢子形成实验、菌丝形成实验、糖发酵实验、碳源同化实验、氮源同化实验、类淀粉化合物生成实验、产酯实验、产酸实验等生理生化特征进行鉴定［5-6］。

1.3.3酵母菌的5.8S rDNA分析

（1）酵母菌基因组DNA的提取

将上述纯化的酵母菌接种于YEPD液体培养基中置于25℃培养36 h后，取1 mL活化菌悬液，12 000 r/min离心1 min，收集沉淀即为菌体。按照酵母菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）说明书上的方法进行操作，然后将所提取的DNA于-20℃保存。

（2）5.8S rDNA PCR扩增

将上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，使用引物ITS 1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS 4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［7］对5.8S-ITS区域酵母菌DNA进行扩增；采用50μL反应体系：DNA模板2 μL，ITS1（10 μmol/L）2 μL，ITS4（10 μmol/L）2 μL，2xTaqPCR MasterMix 25 μL，加ddH2O补至50 μL。

PCR反应循环条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环次数为35次；72℃延伸10 min。

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电压100 V，电泳液为1×TAE。电泳后，用GoldView染色20 min，紫外灯下观察，拍照。

（3）扩增产物测序及系统发育分析

PCR产物经电泳检测合格后，送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，测得的序列在美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）数据库中进行同源序列搜索，从数据库获得相关种属的5.8S rDNA基因序列，采用软件Mega5.0中的Neighbor-Joining方法与标准菌株基因序列进行比对，进行1 000次Bootstrap检验后构建系统发育树。

2　结果与分析

2.1分离菌株形态特征

酵母菌在经YEPD培养基活化后，将分离菌株在普通光学显微镜下，观察菌落和细胞形态。酵母菌菌落形态如图1、表1所示，细胞形态和繁殖方式见表2。

图1　分离酵母菌株菌落形态Fig.1 Colony morphology of isolated yeasts

由图1和表1可知，采用传统纯培养分离的方法，从采集的10个奶酪样品中，经过菌种的分离纯化，共得到44株酵母菌，酵母菌菌落形态呈圆形或椭圆形，颜色呈乳白色或淡黄色，表面光滑或干燥，边缘整齐，表面凸起，呈现半透明状或不透明。由表2可知，分离菌株繁殖方式多为无性繁殖，且无菌丝或有假菌丝，细胞形态多为圆和椭圆形，细胞形态符合酵母菌特征。

表1　分离菌株的菌落形态鉴定结果Table 1 Identification results of colony morphology of isolated strains

续表

表2　分离菌株细胞形态和繁殖方式鉴定结果Table 2 Identification results of cell morphology and reproductive modes of isolated strains

2.2分离菌株的理化性质鉴定结果

酵母菌的理化性质鉴定结果见表3，碳源、氮源同化鉴定结果见表4。

表3　酵母菌的生理生化性质鉴定结果Table 3 Identification results of physiological and biochemical properties of yeasts

表4　碳源、氮源同化鉴定结果Table 4 Identification results of carbon and nitrogen source assimilation

由表3、表4可知，采用传统形态学、生理生化特性方法对酵母菌进行鉴定，依据《酵母菌的特征与鉴定手册》，根据实验结果发现，分离株均为芽殖，有些有假菌丝，在发酵实验中，除葡萄糖发酵外不发酵其他被检糖，在碳源同化实验中可同化乙醇和柠檬酸，氮源同化实验中不能同化硝酸盐，属于毕赤氏酵母属（Pichia）；部分分离菌株（如菌株4-2、4-5、7-1、9-3、9-4和9-6）葡萄糖发酵阳性，硝酸盐还原、类淀粉物质的生成试验阴性，属于有孢圆酵母属（Torulaspora）；还有部分菌株仅依据生理生化鉴定结果，无法对其种属进行判断。

2.3酵母菌的5.8S rDNA鉴定

2.3.1分离菌株5.8S rDNA PCR扩增结果

对44株酵母菌分离株进行分子生物学鉴定，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，检测结果如图2所示。由图2可知，在450～750 bp之间获得特异性扩增条带，符合酵母菌5.8S rDNA区理论预期值［8］，可初步鉴定为酵母菌。

图2　分离菌株5.8S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.2 PCR amplification products electrophoretogram of 5.8S rDNA of isolated strain

2.3.2基于5.8S rDNA基因序列的酵母菌株系统发育分析44株分离酵母菌的分子生物学鉴定结果如表5所示。

表5　44株酵母菌的ITS序列鉴定结果Table 5 Identification results of ITS sequence of 44 yeast strains

由表5可知，奶酪中的44株分离株，经鉴定属于3属5种，其中库德毕赤酵母（P.kudriavzevii）为优势菌株，占总分离菌株中的77%；其次为戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）。

从44株分离菌株中挑选出生长较为旺盛、生理生化特征典型、具有代表性的15株分离菌株（1-1、2-1、3-5、4-2、 4-5、5-3、6-2、7-1、8-1、9-3、9-4、9-6、10-3、10-4、10-6），在NCBI序列数据库中进行序列搜索，以比较分离出的酵母菌菌株与已知酵母菌菌株相应序列的相似程度，基于ITS区序列构建系统发育树，如图3所示。

图3　15株分离菌株的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of 15 isolated strains

由图3可知，分离菌株10-4与标准菌株的同源性为97%，根据酵母种类的划分依据，同源相似率低于99%的，不能划为同一个种［9］，但结合生理生化鉴定结果，可判断此菌株为马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。其余所有分离菌株与之对应的标准菌株的同源性均在99%及以上，表明其具有较近的亲缘性。菌株4-2、4-5、7-1、9-3、9-4、9-6鉴定为戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）；菌株10-3鉴定为乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）；菌株10-6鉴定为发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）；菌株1-1、2-1、3-5、5-3、6-2、8-1鉴定为库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

JAKOBSEN M等［10］发现奶酪中汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、溶磷白地霉（Galactomyces geothricum）和解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）是最主要的酵母种属；LOPANDIC K等［11］研究表明，新鲜奶酪中常分离出涎沫假丝酵母菌（Candida zeylanoides）、马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）；MOGENS J等［12］认为通常干酪中的酵母主要有白地霉（Geotrichum candidum）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、链形念珠菌（Candida catenulate）、解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）；马春燕等［13］对新疆哈萨克族传统手工发酵制作的乳酪中所含发酵菌的种类进行鉴定，结果表明其中的主要酵母菌为单孢酿酒酵母（Saccharomyces unisporus）和东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）；李宇辉等［14］从新疆伊犁牧区采集奶酪样品20份，经鉴定主要的酵母菌为发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由此来看，本研究分离得到的酵母菌有其独特的发酵菌种类，可能与其传统的制作方法，当地的环境、气候、发酵温度［15］等因素有关。但从目前许多对发酵乳制品中酵母菌的研究来看，尚未发现对传统乳制品中库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）的详尽报道。

3　结论

本研究对新疆塔城地区哈萨克族传统奶酪中的酵母菌进行分离鉴定，从采集的10份样品中分离纯化得到44株酵母菌，通过形态学观察、生理生化试验和对5.8S rDNA序列进行PCR扩增相结合的方法进行鉴定。鉴定结果表明，44株酵母菌中有6株为戴尔有孢圆酵母（T.delbrueckii）；2株为乳酸克鲁维酵母（K.lactis）；1株为发酵毕赤酵母（P. fermentans）；1株为马克思克鲁维酵母（K.marxianus）；剩余34株均为库德毕赤酵母（P.kudriavzevii）。

全面系统地了解塔城牧区奶酪中酵母菌的构成，并对其中性能优良的酵母菌菌种进行收集和保存，使这一宝贵的资源得到保护，避免酵母菌资源的丢失，深入地研究和认识酵母菌资源，这对我国酵母菌资源的保护、开发和利用有着重要意义。

［1］倪慧娟.新疆地区和青海地区传统发酵乳制品中酵母菌的生物多样性［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2009.

［2］董晓婉.新疆和布克赛尔县哈萨克族和蒙古族传统乳制品中乳酸菌菌群多样性的研究［D］.石河子：石河子大学，2014.

［3］杜琨，张亚宁.干酪的营养价值及研究动态［J］.中国食物与营养，2005（10）：45-46.

［4］VASDINYERI R，DEAK T.Characterization of yeast isolates originating from Hungarian dairy products using traditional and molecular identification techniques［J］.Food Microbiol，2003，86（2）：123-130.

［5］BARNETT J.Yeasts characteristics and identification［M］.2nd editioned. Cambridge：Cambridge University Press，1990：48-233.

［6］郝林.食品微生物实验技术［M］.北京：中国农业出版社，2001：147-159.

［7］MU Z S，YANG X J，YUAN H L.Detection and identification of wild yeast in Koumiss［J］.Food Microbiol，2012，31（2）：301-308.

［8］苟荣.5.8S rDNA和ITS序列同源性分析在酸马奶酵母菌分子生物学鉴定中的应用［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.

［9］KURTZMAN C P，ROBNNETT C J.Identification and phylogeny of as comycetous yeasts for analysis of nuclear large subunit ribosomal DNA partial sequence［J］.Anton Leeuw，1998，73：331-371.

［10］JAKOBSEN M，LARSEN M D，JESPERSEN L.Production of bread，cheese and meat［M］.Berlin Heidelberg：Springer-Verlag，2012：3-22.

［11］LOPANDIC K，ZELGER S，BANSZKY L K.Identification of yeasts associated with milk products using traditional and molecular techniques［J］.Food Microbiol，2006（23）：341-350.

［12］MOGENS J，NARVHUS J.Yeasts and their possible beneficial and negative effects on the quality of dairy products［J］.Int Dairy J，1996，6（8）：755-768.

［13］马春燕，新华·那比，刘红梅.哈萨克族传统发酵乳酪中发酵菌的分离鉴定［J］.中国乳品工业，2012，38（4）：7-9.

［14］李宇辉.新疆伊犁牧区发酵乳制品中酵母菌的分离和多样性分析［J］.食品与发酵工业，2013，39（7）：98-103.

［15］王冠群，韩培杰，杨文菊，等.新疆传统发酵乳制品及酵头中酵母菌的分离鉴定［J］.食品与生物技术学报，2015，34（7）：691-698.

Isolation and identification of yeast from traditional cheese of Kazak in Tacheng region of Xinjiang

LU Wenjuan，LI Baokun*，LU Shiling
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

In order to protect superior yeast strains from traditional cheese of Kazak in Tacheng region of Xinjiang，44 yeast strains were isolated from 10 samples of traditional cheese.The isolated strains were identified by colonial morphology，physiological and biochemical characteristics identification and 5.8S rDNA sequence homology analysis.Five species were identified，including 34 strains ofPichia kudriavzevii，six strains ofTorulaspora delbrueckii，two strains ofKluyveromyces lactis，one strain ofKluyveromyces marxianusand one strain ofPichia fermentans.Results showed that the yeasts in traditional cheese of Kazak were different with that in other regions，and had its unique resources.

cheese；yeast；isolation and identification

TS201.3

0254-5071（2016）07-0024-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.006

2016-03-07

国家自然基金地区项目（31460007）

芦文娟（1991-），女，硕士研究生，研究方向为乳制品微生物。

李宝坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向为乳制品微生物。