中心组合设计优化合生元酸马乳中乳酸菌的生长

王小标，武 运，王 璐，苗 森，古丽娜孜，张亚南，王 威（.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐80052；2.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉800；.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐80052）

中心组合设计优化合生元酸马乳中乳酸菌的生长

王小标1，2，武 运1，*，王 璐3，苗 森1，古丽娜孜1，张亚南1，王 威1
（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.昌吉市农产品质量安全检验检测中心，新疆昌吉831100；3.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐830052）

为了研究四种不同低聚糖对合生元酸马乳中乳酸菌生长的影响，通过单因素实验筛选出促进酸马乳中乳酸菌生长的3种低聚糖，并运用中心组合实验及响应面分析，优化了3种低聚糖的最佳添加量。结果表明：3种低聚糖的最佳添加量为：低聚半乳糖1.30%（W/V）、低聚异麦芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.40%（W/V），在最优条件下合生元酸马乳中乳酸菌活菌数可达到（5.97±0.16）×108CFU/mL，比优化前提高了70.57%。

酸马乳，乳酸菌，低聚糖，中心组合设计

益生元是一类不易被人体消化，可以选择性刺激人体肠道中益生菌生长和活性，从而有益于人体健康的食物成分［1］。目前，常用的益生元主要是一些功能性低聚糖，如低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、菊粉和大豆低聚糖等［2-4］。研究认为，益生元可以促进双歧杆菌等有益菌的生长繁殖，并代谢产生大量的乳酸、乙酸等有机酸和细菌素等抗菌物质，抑制外源和肠道固有有害菌的生长，改善肠道菌群微生态环境，提高机体免疫力［5-7］。由于低聚糖的这些益生特性，其作为一种功能性食品原料受到了国内外学者的广泛关注。

前人研究发现，低聚糖对乳酸菌生长的影响不仅具有菌株特异性，而且与低聚糖的聚合度、糖苷键类型和单糖组分密切相关［8-10］。Saminathan等［11］发现，乳杆菌菌株和发酵基质不同，11株益生乳杆菌对低聚糖的利用能力不同。Hu等［12］发现，乳杆菌仅能代谢短链低聚异麦芽糖，而双歧杆菌优先利用高聚合度的低聚糖。Sharma［13］和李雅松［14］认为，低聚糖对乳酸菌的促生长作用与其浓度有一定的关系，持续增加低聚糖的添加量并不能提高乳酸菌活菌数。因此，筛选适宜的益生元对开发生产合生元具有重要的意义。

现有研究多集中于单一低聚糖对益生菌生长的影响，没有考虑多种低聚糖复合对益生菌菌株生长的影响。本研究以酸马乳中益生菌生长情况为评价指标，通过单因素实验筛选出对酸马乳中乳酸菌生长有促进作用的低聚糖，再运用中心组合实验设计确定低聚糖的最优添加量，以提高酸马乳中乳酸菌活菌数，开发一种新型合生元酸马乳制品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜马乳 购于新疆乌鲁木齐南山地区；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）MLS5、乳酸乳球菌（Lactococus lactis）WLB5和马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）WWMJ1 均由新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供；MRS肉汤、改良MC培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeastextractpeptonedextrosemedium，YPD）、孟加拉红培养基 青岛日水生物技术有限公司；低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO）、低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）、低聚木 糖（xylooligosaccharide，XOS）、低 聚 果 糖（fructooligosaccharides，FOS） 上海陆安生物科技有限公司。

FA2014N分析天平 北京东南仪诚实验室设备有限公司；HR40-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DHP-9052电热恒温培养箱、HWS-26电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；FE20K pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

1.2.1.1 低聚异麦芽糖对酸马乳中发酵菌株生长的影响 分别添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚异麦芽糖于新鲜马乳中，灭菌冷却后按6%接种量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1，乳酸菌由1∶1的干酪乳杆菌和乳酸乳球菌组成）接种，于32℃条件下恒温发酵48 h，考察低聚异麦芽糖对发酵酸马乳中乳酸菌、酵母菌生长的影响，以及对酸马乳pH和酒精含量的影响。

1.2.1.2 低聚半乳糖对酸马乳中发酵菌株生长的影响 分别添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚半乳糖于新鲜马乳中，灭菌冷却后按6%接种量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1）接种，于32℃条件下恒温发酵48 h，考察低聚半乳糖对发酵酸马乳中乳酸菌、酵母菌生长的影响，以及对酸马乳pH和酒精含量的影响。

1.2.1.3 低聚木糖对酸马乳中发酵菌株生长的影响

分别添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚木糖于新鲜马乳中，灭菌冷却后按6%接种量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1）接种，于32℃条件下恒温发酵48 h，考察低聚木糖对发酵酸马乳中乳酸菌、酵母菌生长的影响，以及对酸马乳pH和酒精含量的影响。

1.2.1.4 低聚果糖对酸马乳中发酵菌株生长的影响

分别添加0.00%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的低聚半乳糖于新鲜马乳中，灭菌冷却后按6%接种量（乳酸菌∶酵母菌=1∶1）接种，于32℃条件下恒温发酵48 h，考察低聚果糖对发酵酸马乳中乳酸菌、酵母菌生长的影响，以及对酸马乳pH和酒精含量的影响。

1.2.2 中心组合实验设计（Central Composite Design）

在单因素实验的基础上，利用中心组合实验设计，以低聚异麦芽糖、低聚半乳糖和低聚木糖的不同添加量为考察因子，以酸马乳中乳酸菌活菌数为响应值，建立响应值与考察因子之间的二次多项回归模型。中心组合实验设计因素与水平编码值见表1。

表1 中心组合实验设计因素和水平编码值Table1 Factors，levels，and codes of central composite design

1.2.3 活菌计数 酸马乳中乳酸菌计数采用改良MC琼脂培养基倾注培养，于37℃恒温培养2 d；酵母菌计数采用孟加拉红琼脂培养基涂布培养，于28℃恒温培养2 d［15］。

1.2.4 pH的测定 pH测定采用FE20K pH计。

1.2.5 酒精度的测定 采用酒精计测定酸马乳的酒精含量［16］。

1.2.6 数据分析 采用Design-Expert 8.05软件进行中心组合实验设计；应用SPSS 20.0软件进行数据分析；利用Sigmaplot 12.5软件绘制曲线。

2 结果与分析

2.1 不同低聚糖对酸马乳中乳酸菌生长的影响

图1 低聚异麦芽糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响Fig.1 Effect of IMO on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.1.1 低聚异麦芽糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响 由图1可知，随着低聚异麦芽糖添加量的增加，酸马乳中乳酸菌活菌数呈现先升高后下降的趋势，当低聚异麦芽糖的添加量为1.00%，酸马乳中乳酸菌活菌数达到最高，为5.80×108CFU/mL，显著高于对照组和其他浓度的低聚异麦芽糖组（p＜0.05），表明低聚异麦芽糖可以显著促进合生元酸马乳中乳酸菌的生长。李雅松［14］和万荣峰［17］均发现低聚异麦芽糖对乳酸菌有生长促进作用，而且促生长效果与低聚异麦芽糖的浓度相关，酸马乳中酵母菌的活菌数随着低聚异麦芽糖添加量的增加呈现先降低后升高的趋势，而且低聚异麦芽糖添加量高于0.50%时，酸马乳中酵母菌活菌数均显著低于对照组（p＜0.05）。可能是由于酸马乳中乳酸菌活菌数的提高加剧了乳酸菌与酵母菌之间的营养竞争，从而使酵母菌活菌数有所下降。添加不同量的低聚异麦芽糖对酸马乳的pH无明显影响，发酵结束后，酸马乳pH介于4.48～4.71之间，酒精度均在0.70%vol以上。

2.1.2 低聚半乳糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响 由图2可知，随着低聚半乳糖添加量的增加，酸马乳中乳酸菌活菌数呈现先升高后下降的趋势，当低聚半乳糖的添加量为1.00%，酸马乳中乳酸菌活菌数达到最高，为5.83×108CFU/mL，显著高于对照组和其他浓度的低聚半乳糖组（p＜0.05），表明适当添加量的低聚半乳糖可以显著促进合生元酸马乳中乳酸菌的生长。贺晋艳等［18］发现α-低聚半乳糖可以促进肠道益生菌的生长。Ignatova等［19］发现低聚半乳糖的添加量对发酵乳杆菌的生长速率有显著影响。酸马乳中酵母菌的活菌数随着低聚半乳糖添加量的增加呈现先降低后升高的趋势。除添加量为1.00%外，其他浓度低聚半乳糖组酵母菌活菌数与对照组均无显著差异（p＞0.05）。添加不同量的低聚半乳糖对酸马乳的pH无明显影响，发酵结束后，酸马乳pH介于4.56～4.60之间，酒精度均在0.90%vol以上。

图2 低聚半乳糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响Fig.2 Effect of GOS on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.1.3 低聚木糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响 由图3可知，当低聚木糖添加量为0.50%时，对酸马乳中乳酸菌的生长有一定的促进作用，乳酸菌活菌为4.35×108CFU/mL。低聚木糖添加量较高时，对合生元酸马乳中乳酸菌的生长表现出一定的抑制作用。张荣斌［20］发现低聚木糖可显著促进肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌的生长。当低聚木糖的添加量高于1.00%时，酸马乳中酵母菌的活菌数均高于对照组。可能是由于低聚木糖对合生元酸马乳中酵母菌的生长有促进作用，或者是由于乳酸菌的生长受到抑制，从而酵母菌的生长占据了优势。添加不同量的低聚木糖对酸马乳的pH无明显影响，发酵结束后，酸马乳pH介于4.34～4.36之间，酒精度均在1.20%vol以上。

图3 低聚木糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响Fig.3 Effect of XOS on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.1.4 低聚果糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响 由图4可知，随着低聚果糖添加量的增加，酸马乳中乳酸菌活菌数逐渐下降，表明添加低聚果糖对酸马乳中乳酸菌的生长有一定的抑制作用，与张晓峰等［21］研究结果不一致。可能是由于低聚果糖的聚合度、结构和糖苷键的不同导致的。高颖等［22］发现唾液乳杆菌会优先代谢利用蔗果三糖，对蔗果四糖利用率较低，不能利用蔗果五糖。低浓度的低聚果糖对酸马乳中酵母菌的生长无明显作用，当低聚果糖的添加量高于1.00%时，对酸马乳中酵母菌有显著的促生长作用（p＜0.05），可能是由于低聚果糖高浓度添加量时，合生元酸马乳中酵母菌的生长占据优势。添加不同量的低聚果糖对酸马乳的pH无明显影响，发酵结束后，酸马乳pH介于4.33～4.43之间，酒精度均在0.50%vol以上。

图4 低聚果糖对酸马乳中发酵菌株生长、产酸及酒精度的影响Fig.4 Effect of FOS on the growth of cultures，pH and alcohol degree of koumiss

2.2 中心组合实验设计

利用Design-Expert 8.05对酸马乳中乳酸菌生长进行中心组合实验设计，实验设计的结果见表2。

表2 中心组合实验设计及结果Table2 Experimental design and results of the central composite design

根据表2中心组合实验设计结果进行回归分析，得到合生元酸马乳中乳酸菌活菌数（Y）对低聚半乳糖（A）、低聚异麦芽糖（B）和低聚木糖（C）添加量的拟合方程为：Y=8.77+0.028A-0.018B-0.0069C-0.02AB-0.017AC+0.0075BC-0.041A2-0.037B2-0.039C2，对拟合方程进行方差分析，结果如表3所示。

表3 回归方程方差分析Table3 Analysis of variance of regression equations

由表3可知，本实验建立的回归模型极显著（p＜0.0001）；而模型失拟项p=0.4928＞0.05，说明模型失拟项不显著，由此说明所建立的模型具有良好的显著性。模型决定系数R2=0.9560，校正决定系数R2Adj= 0.9165，表明该模型能较好拟合实际实验中响应值的变化，利用此模型可以对合生元酸马乳中乳酸菌活菌数进行分析和预测。从表3可以看出，一次项A、B和二次项A2、B2、C2对响应值的影响均为极显著（p＜0.01），交互项AB、AC对响应值存在显著的交互作用（p＜0.05）。

2.3 响应面分析与优化

图5 低聚半乳糖与低聚异麦芽糖交互作用响应面图Fig.5 Response surface for the effect of GOS and IMO on the growth of LAB

图6 低聚半乳糖与低聚木糖交互作用响应面图Fig.6 Response surface for the effect of GOS and XOS on the growth of LAB

图7 低聚异麦芽糖与低聚木糖交互作用响应面图Fig.7 Response surface for the effect of IMO and XOS on the growth of LAB

利用Design-Expert 8.05软件对回归模型进行响应面优化，运用Sigmaplot 12.5绘制交互项三维响应面图（图5～图7），可以比较直观看出各个因素两两之间交互作用对响应值的影响。由图5～图7可以看出，在低聚木糖添加量一定时，随着低聚半乳糖和低聚异麦芽糖添加量的增加，合生元酸马乳中乳酸菌活菌数先升高后降低，差异显著，说明低聚半乳糖与低聚异麦芽糖之间的交互作用显著；在低聚异麦芽糖添加量一定时，随着低聚半乳糖和低聚木糖添加量的增加，合生元酸马乳中乳酸菌活菌数先升高后降低，差异显著，说明低聚半乳糖与低聚木糖之间的交互作用显著。通过Design-Expert 8.05对建立的回归方程进行参数最优化分析，可以得出合生元酸马乳中乳酸菌活菌数最高时低聚半乳糖、低聚异麦芽糖和低聚木糖的最佳添加量，即低聚半乳糖1.25%（W/V）、低聚异麦芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.43%（W/V）。在此条件下，酸马乳中乳酸菌活菌数预测值为8.7766 lg CFU/mL。

2.4 验证实验

为检验所建立的多元回归模型的准确性，同时考虑实验操作方便，在低聚半乳糖1.30%（W/V）、低聚异麦芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.40%（W/V）条件下进行合生元酸马乳发酵实验，实验平行3次，得到的合生元酸马乳中乳酸菌活菌数分别为（5.97±0.16）×108CFU/mL，其对数值为（8.7757±0.0116）lg CFU/mL，乳酸菌活菌数平均值为与预测值较为接近，说明该模型准确可靠，能较好预测合生元酸马乳中乳酸菌活菌数。验证实验中空白对照组乳酸菌活菌数为（3.50±0.17）×108CFU/mL，优化结果与空白对照相比提高了70.57%。

3 结论

在单因素实验的基础上，利用Design-Expert 8.05软件对酸马乳中乳酸菌活菌数进行了响应面优化，得出三种低聚糖的最佳添加量分别为低聚半乳糖1.30%（W/V）、低聚异麦芽糖0.80%（W/V）、低聚木糖0.40%（W/V）。在此条件下发酵的酸马乳中乳酸菌活菌数达（5.97±0.16）×108CFU/mL。优化结果比空白对照提高了70.57%，可为合生元酸马乳饮品开发和酸马乳制品中乳酸菌活菌数的提高提供一定的理论参考。

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Optimization of growth of lactic acid bacteria in synbiotics koumiss by central composite design

WANG Xiao-biao1，2，WU Yun1，*，WANG Lu3，MIAO Sen1，GU Li-nazi1，ZHANG Ya-nan1，WANG Wei1
（1.College of Food Science and Pharmaceutical Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Changji Examing and Inspection Center for Agricultural Products Safety and Quality，Changji 831100，China；3.College of Science and Technology，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）

In order to study the effects of different oligosaccharides on the growth of lactic acid bacteria in synbiotics koumiss，three oligosaccharides for promoting the growth of lactic acid bacteria were screened via single factor experiment，and the optimal additions of three substrates were confirmed by central composite design and response surface analysis.The results indicated that the optimal additions of three oligosaccharides were 1.30%（W/V）of galacto-oligosaccharides，0.80%（W/V）of isomaltooligosaccharide and 0.40%（W/V）of xylooligosaccharides.Under the optimal conditions，the viable counts of lactic acid bacteria could reach up to （5.97±0.16）×108CFU/mL，which revealed an increase by 70.57%.

koumiss；lactic acid bacteria；oligosaccharides；central composite design

TS252.4

A

1002-0306（2016）06-0216-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.036

2015－07－27

王小标（1989-），男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术，E-mail：wxiaobiao@sina.com。

武运（1965-），女，硕士，教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：wuyunster@sina.com。

新疆维吾尔自治区重大专项子课题（201130101-4（2）-2）；国家科技部“十二五”科技支撑项目子课题（2012BAD44B01-05）。