苜蓿盐诱变愈伤组织的生理生化特性

杨静慧，王 葳，秦艳筠，刘艳军，张景新，张 超（.天津农学院 园艺园林学院，天津 0084，.天津市蓟县林业局，天津0900， .天津市朔方绿化科技有限公司，天津 0084）

试验研究

苜蓿盐诱变愈伤组织的生理生化特性

杨静慧1，王 葳1，秦艳筠1，刘艳军1，张景新2，张 超3
（1.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384，2.天津市蓟县林业局，天津301900， 3.天津市朔方绿化科技有限公司，天津 300384）

为了了解耐盐突变体的生理变化，以“青睐”苜蓿耐盐突变体的愈伤组织为试材，检测了该组织的细胞可溶性糖、丙二醛、可溶性蛋白、游离脯氨酸等的含量，分析了其细胞膜透性、离子浓度和SOD、POD酶活性。结果显示，与对照相比耐盐突变体细胞中有更多的可溶性糖、游离脯氨酸，更少的丙二醛、可溶性蛋白和Na+、K+，细胞膜的透性更高。但其SOD和POD的酶活性的变化规律不明显。

苜蓿；愈伤组织；耐盐；生理指标

苜蓿是豆科苜蓿属的多年生草本植物，是一种全球性栽培、营养价值高、适应性广、适口性优良的饲料作物，素有“牧草之王”和“饲料皇后”的美称[1]。同时苜蓿也可以作为绿肥、轮作倒茬作物、护地固地和草坪绿化观赏植物[2]。然而，50～200 mmol·L-1NaCl胁迫就会显著降低苜蓿的产量[3]。目前，全世界的盐渍地约占陆地面积的30%，而中国的盐渍地比例明显高于世界平均水平，天津东部滨海平原区土壤盐渍化尤其严重[4]。如果可以提高苜蓿的耐盐性，在盐渍地区种植苜蓿，既可以改良土壤绿化环境，还可以创造经济效益。通过对耐盐苜蓿突变体愈伤组织的8项生理指标的研究，了解突变体在生理生化代谢上的变化规律，为耐盐苜蓿的育种提供了理论依据。

1　材料和方法

试验使用的对照苜蓿品种“青睐”购于中国农科院，耐盐愈伤组织由天津农学院植物教研室提供，通过高盐筛选获得的突变体细胞系，方法见刘艳军和QIN Y J的研究报道[5-6]。取耐盐突变体和对照的子叶进行愈伤组织培养，方法见QIN Y J的报道[6]。愈伤组织生理指标测定方法为：可溶性糖含量用蒽酮法、SOD酶活性用氮蓝四唑光化还原法、POD酶活性采用愈创木酚比色法和Lambda35紫外分光光度计测定、丙二醛含量用硫代巴比妥酸比色法和用Lambda35紫外分光光度计测定、细胞膜透性用电导率法、可溶性蛋白含量用紫外吸收法、游离脯氨酸含量用茚三酮显色法、Na+和K+含量用原子分光光度计测定（PerkinElmer AAnalyst 400型）。每处理3次重复。

2　结果与分析

2.1耐盐愈伤组织的可溶性糖含量

图1显示，耐盐愈伤组织的可溶性糖含量高于对照愈伤组织。对照可溶性糖含量为25.03%，耐盐愈伤组织含量为27.42%，是对照的 1.1倍。可溶性糖是一种重要的渗透调节剂；也是合成有机物的碳架和能量来源；对细胞膜和原生质胶体有稳定作用；还可在细胞内无机离子含量高时起保护酶类的作用[7]。耐盐愈伤组织可溶性糖含量高，说明其渗透压较高，所以在盐浓度较高的环境中可以更容易从外界吸收水分来维持生长。

图1　耐盐愈伤组织的可溶性糖含量

2.2耐盐愈伤组织的SOD酶活性

图2显示，耐盐愈伤的SOD酶活性低于对照愈伤组织。对照的SOD酶活性为3.04 U，耐盐愈伤的为2.20 U，前者是后者的1.38倍。有关研究表明，植物体在盐胁迫下SOD的活性的变化因植物种类不同而不同[8-10]。组织中SOD酶活性低的可能表示需要较高的盐浓度才能造成对组织的胁迫引起反应，也说明该组织的耐盐性强。

图2　耐盐愈伤组织的SOD酶活性

2.3耐盐愈伤的POD酶活性

图3显示，耐盐愈伤组织的POD酶活性高于对照愈伤组织。对照的POD酶活性为25.35 U，耐盐愈伤组织的POD酶活性为34.81 U，后者是前者的1.37倍。POD酶的作用是清除过氧化氢，以免损伤自身细胞[11]。有报道显示具有较高的POD酶活性的植物，具有较强的耐盐性；但是，也有相反的报道[6,9,10.12]。

图3　耐盐愈伤组织的POD酶活性

2.4耐盐愈伤组织的丙二醛含量

图4显示，耐盐愈伤组织的丙二醛含量低于对照愈伤组织。对照丙二醛含量为0.79 μ mol· g-1，耐盐愈伤组织含量为0.45 μ mol·g-1，前者是后者的1.77倍。丙二醛是膜脂过氧化的主要产物，其含量高低是显示膜脂过氧化强弱的重要指标，其数值越大，表示质膜受到的伤害越大，其耐盐性也越差[6]。

图4　耐盐愈伤组织的丙二醛含量

2.5耐盐愈伤组织的细胞膜透性

图5显示，愈伤组织中细胞膜透性都较低（<0.32%），其中耐盐愈伤组织的细胞膜透性高于对照。对照愈伤组织的细胞膜透性为0.13%，耐盐愈伤的细胞膜透性为0.31%，后者是前者的2.38倍。盐胁迫以及其他任何环境胁迫所造成的植物细胞膜的损坏，会使细胞膜的透性增大[13]。但是，本试验高压筛选出来的愈伤组织生长旺盛，无任何受害症状，生理代谢也正常。所以在正常生长条件下，耐盐愈伤组织细胞具有更高的细胞膜透性。

图5　耐盐愈伤组织的细胞膜透性

2.6耐盐愈伤组织的可溶性蛋白和游离脯氨酸的含量

图6和图7显示，耐盐愈伤的可溶性蛋白含量低于对照愈伤组织，但游离脯氨酸含量高于对照愈伤组织。对照愈伤组织中的可溶性蛋白含量为2.25 mg·mL-1，耐盐愈伤中可溶性蛋白含量为1.91 mg·mL-1，前者是后者的1.18倍；对照愈伤组织中的游离脯氨酸含量为94.84 μ g·g-1，耐盐愈伤中的游离脯氨酸含量为599.87 μ g·g-1，后者是前者的6.33倍。邵红雨等[7]在植物耐盐生理生化特性的研究中指出，脯氨酸是一种重要的有机渗透调节物质，是植物蛋白质的组分之一，并以游离的状态广泛存在于植物体内。植物在盐胁迫等逆境条件下积累游离脯氨酸是一种比较普遍的现象。游离脯氨酸积累的作用大致有：（1）可以作为细胞的有效调节物质；（2）具有保护酶和膜的作用；（3）可以直接利用的无毒形式的氮源。所以，上述结果表明经过高盐胁迫诱变得到的耐盐愈伤组织具有将细胞中大量的可溶性蛋白转化为游离脯氨酸的功能，这应是其耐盐的原因之一。

图6　耐盐愈伤组织的可溶性蛋白含量

图7　耐盐愈伤组织的游离脯氨酸含量

2.7耐盐愈伤组织的Na+、K+浓度

图8显示，耐盐愈伤组织的Na+、 K+浓度低于对照愈伤组织。对照愈伤组织中Na+含量为5.70 mg·L-1，耐盐愈伤中Na+含量为2.90 mg· L-1，前者是后者的1.97倍；对照愈伤组织中的K+含量为4.81 mg·L-1，耐盐愈伤中的K+含量为4.04 mg·L-1，前者是后者的1.2倍。对照愈伤组织的K+/ Na+为0.84 ，耐盐愈伤的K+/ Na+为1.39，后者是前者的1.65倍。耐盐愈伤中的Na+浓度明显下降，虽然K+浓度也有所下降，但K+/ Na+较对照愈伤组织升高许多。这可有效维持生长发育所需的K+/ Na+，提高对Na+胁迫的耐受性[14]。

图8　耐盐愈伤组织的K+、Na+离子浓度变化

3　结 论

综上所述，与普通愈伤组织相比，耐盐愈伤组织细胞中有更多的可溶性糖、游离脯氨酸，更少的丙二醛、可溶性蛋白、Na+、K+离子，更高的细胞膜透性。其SOD和POD酶活性的变化需要进一步论证。

[1]曹宏，章会玲，盖琼辉，等.22个紫花苜蓿品种的引种试验和生产性能综合评价[J].草业学报，2011，20（6）：219-229.

[2]张玉发.试论苜蓿生产在我国农业三元种植结构调整中的地位和作用[J].草业科学，1999，16（2）：10-12.

[3]BEKKI A ,TRINCHANT J C，RIGAUD J, et al. Nitrogen fixation（C2H2reduction）by Medicago nodules and bacteroids under sodium chloride stress [J].Physiologia Plantarum,1987,71:61-67.

[4]田瑞娟，刘艳军，杨静慧，等.不同激素不同外植体对苜蓿品种再生的影响[J].南方农业，2007，1（3）：13-14.

[5]刘艳军，张超，杨静慧，等.塔杨松散型均质胚性愈伤组织培养体系[J].植物研究， 2016，36（1）：123-128.

[6] QIN Y J, GONG W Q, LIU T, et al. Difference of morphological structure and characteristics of physiology and biochemistry between two types of alfalfa callus [J].Applied Mechanics and Materials , 2015 ,700: 306-309.

[7]邵红雨，孔广超，齐军仓，等.植物耐盐生理生化特性的研究进展[J].安徽农学通报，2006，12（9）：51-53.

[8]李双跃，王丹丹，杨静慧，等.芦苇、香蒲、荷花的耐盐性研究[J].北方园艺，2012（20）：61-63.

[9]龚无缺，杨静慧，徐慧洁，等.不同类型的土壤对3个樱桃品种生理生化特性的影响[J].天津农学院学报，2015，22（3）：24-27。

[10]LIANG F H, YANG J H, LIU Y J, et al. Physiological and biochemical changes of cherry rootstocks under salt stresses in greenhouse environment [J]. Advanced Materials Research, 2014,1051: 368-372.

[11]史如霞.NaCl胁迫对唐古特白刺愈伤组织生理生化特性的影响[D].兰州：西北师范大学，2010.

[12]米伟，杨静慧，程龙，等.盐胁迫下转过表达HS转录因子苜蓿突变体的生理生化变化[J].分子植物育种，2014，13（3）：685-662.

[13] 刘婷，程龙，杨静慧，等.13种植物耐盐性的离体快速分析[J].天津农学院学报，2014，21（4）：5-8.

[14] HORIE T, SCHROEDE J I. Sodium transporters in plants. Diverse genes and physiological functions[J]. Plant Physiol ，2004(136):2457-2462.

S551+.703.4

A

1002-0659（2016）04-0001-03

2016-03-22

主要作者简介：杨静慧（1961-），女，教授，博士，主要从事园艺植物栽培、抗逆生理和分子育种研究。E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com