XRCC1基因多态性对结肠癌患者术后FOLFOX4方案化疗疗效的影响

卢宏全　黄国定　林　影　潘敏丽



XRCC1基因多态性对结肠癌患者术后FOLFOX4方案化疗疗效的影响

卢宏全黄国定林影潘敏丽

目的探讨X射线交错互补修复基因1(XRCC1) Arg399Gln基因多态性对结肠癌患者术后FOLFOX4方案化疗疗效的影响。方法113例结肠癌患者均接受根治术治疗。术后采用焦磷酸测序法检测肿瘤组织中的XRCC1 Arg399Gln基因多态性，并给予FOLFOX4方案化疗6个周期。治疗结束后对患者进行随访。结果⑴113例结肠癌患者的XRCC1 Arg399Gln位点包括Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg等3种等位基因型，其频率分别为66.4%(75/113)、27.4%(31/113)、6.2%(7/113)。⑵Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组之间性别、年龄、病理类型、癌肿部位、肿瘤形态、TNM分期、T分期、癌胚抗原(CEA)相比差异无统计学意义(P>0.05)。⑶随访期内，Gln/Gln基因型组复发转移率显著低于非Gln/Gln基因型组，3年生存率显著高于非Gln/Gln基因型组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论XRCC1 Arg399Gln基因多态性可以影响结肠癌患者术后FOLFOX4辅助化疗的远期疗效。

X射线交错互补修复基因1；基因多态性；结肠癌

(The Practical Journal of Cancer,2016,31:1239～1241)

以手术为主的综合治疗是目前临床治疗结肠癌的主要原则，FOLFOX4方案则是高危Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者术后辅助化疗的标准方案，尽管如此，该方案的疗效常受到多方面因素的影响[1]。X射线交错互补修复基因1(XRCC1) Arg399Gln基因多态性是目前肿瘤学研究的热点之一，诸多报道均认为它可以影响奥沙利铂的抗肿瘤效果[2-4]。本研究即旨在探讨其对结肠癌患者术后FOLFOX4方案化疗疗效的影响，现报告如下。

1　材料与方法

1.1研究对象

选取2009年7月-2012年5月海南省儋州市第一人民医院收治的113例患者，其中男性65例、女性48例，年龄>50岁28例、≤50岁85例；病理类型：腺癌101例、黏液癌9例、未分化癌3例；癌肿部位：近端结肠47例、远端结肠66例；肿瘤形态：肿块型50例、浸润型35例、溃疡型28例；TNM分期：Ⅱ期31例、Ⅲ期82例；T分期：T1～T220例、T3～T493例；癌胚抗原(CEA)正常17例、升高96例。

1.2纳入标准及排除标准

纳入标准：⑴结肠癌根治术后取组织送检，经病理组织学检查确诊；⑵术后接受FOLFOX4方案化疗，化疗周期数为6个；⑶符合结肠癌根治术的治疗指征，临床分期为Ⅱ～Ⅲ期；⑷签署知情同意书，经医院伦理委员会批准。排除标准：⑴未接受XRCC1 Arg399Gln基因多态性检测；⑵临床资料收集不全；⑶随访丢失。

1.3XRCC1 Arg399Gln基因多态性检测方法

1.3.1组织DNA提取包括去除石蜡、组织溶解、DNA柱分离等3个步骤。去除石蜡方法如下：⑴取1 ml 二甲苯置于EP管中，用二甲苯冲淋载玻片上的石蜡切片(片厚4 μm)，湿润后用刀片刮取石蜡组织，二甲苯反复冲淋，将全部二甲苯液转移至EP管中，共刮取2～4块石蜡切片。⑵强力震荡20 s，室温下18 000 rpm离心3 min，弃上清。⑶加入1 ml无水乙醇，震荡混匀，室温下18 000 rpm离心3 min，弃上清。⑷乙醇提取重复1次。组织溶解方法如下：⑴加入180 μl 消化缓冲液、20 μl 蛋白酶K，震荡混匀。⑵50 ℃水浴孵育3 h，室温下18 000 rpm离心3 min，将上清移于另一支EP管。⑶加入20 μl 核糖核酸酶A，震荡混匀，室温孵育2 min。⑷加入200 μl 裂解/结合缓冲液，震荡混匀。⑸加入200 μl 无水乙醇，震荡混匀。DNA柱分离方法如下：⑴吸取组织溶解液，置于小柱中，室温下18 000 rpm离心1 min。⑵更换收集管，向柱子中加入500 μl 缓冲液1，室温下18 000 rpm离心1 min。⑶更换收集管，向柱子中加入500 μl 缓冲液2，室温下18 000 rpm离心3 min。⑷将柱子置于EP管中，加入50 μl 洗脱缓冲液，室温孵育1～5 min，室温下18 000 rpm离心1 min。此时EP管中为gDNA，标记后-20 ℃保存。

1.3.2目的基因PCR片段扩增扩增引物包括XRCC1 25487-pyro BioF：CATCGTGCGTAAGGAGTGG；XRCC1 25487-pyro R：ATTGCCCAGCACAGGATAAG。PCR反应体系包括：dNTP 1.5 μl，10×PCR 缓冲液 5.0 μl，XRCC1 25487-pyro BioF 0.5 μl，XRCC1 25487-pyro R 0.5 μl，rTaq 0.5 μl，ddH2O 40.0 μl，gDNA 2.0 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，72 ℃终延伸5 min。

1.3.3测序样本纯化以及目的基因SNP检测步骤如下：⑴在PSQ 96孔板中加入40 μl 退火缓冲液、3 μl 测序引物。⑵在925 μl 结合缓冲液中加入75 μl磁珠，震荡混匀。⑶在96孔板中先后加入40 μl磁珠混合液以及等体积的PCR产物，封盖，1 900 rpm 震荡10 min。⑷在真空工作站中，4个样品板分别加入180 ml高纯水、120 ml 70%乙醇、变性缓冲液、冲洗缓冲液。⑸打开泵，在高纯水中清洗柱头30 s，将柱头移至PCR板中抓取磁珠。⑹将柱头置入70%乙醇中5 s，移至变性缓冲液中5 s，再移至冲洗缓冲液中5 s。⑺将柱头置于Pyro反应板上方，将泵关掉。⑻将柱头置于含有测序引物的板中，振动释放磁珠，高纯水清洗柱头。⑼将放有样品的PSQ 96孔板置于透明恒温台，加热至80 ℃，2 min后冷却至室温，此时即可进行焦磷酸测序反应。⑽将PSQ 反应板、试剂仓置于测序仪中，点击RUN键。

1.4统计学处理

采用SAS9.0统计软件，计数资料百分率比较采用R×C表χ2检验，生存分析采用Log rank检验，检验水准α=0.05。

2　结果

2.1基因型分布

113例结肠癌患者的XRCC1 Arg399Gln位点包括Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg等3种等位基因型，其构成比分别为66.4%(75/113)、27.4%(31/113)、6.2%(7/113)。

2.2Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组临床资料指标的比较

Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组之间性别、年龄、病理类型、癌肿部位、肿瘤形态、TNM分期、T分期、CEA相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.3Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组远期疗效的比较

随访期内，Gln/Gln基因型组复发转移率显著低于非Gln/Gln基因型组，3年生存率显著高于非Gln/Gln基因型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

3　讨论

结肠癌是胃肠道常见的恶性肿瘤之一。近20年来，其发病率在国内有明显提高，尤其是在大城市，结肠癌有多于直肠癌的趋势[5]。在结肠癌发生、发展过程中，遗传突变包括癌基因激活、抑癌基因失活、基因过度表达、错配修复基因突变等发挥了举足轻重的作用。随着研究的深入，遗传突变与结肠癌患者预后的关系逐步得到重视。

表1　Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组临床资料指标的比较/例

表2　Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组远期预后的比较(例，%)

XRCC1是一个参与电离辐射所致DNA损伤修复的基因，该基因定位于19号染色体q13.2-q13.3，包含17个外显子，编码1个分子量为70 kD的蛋白质[6]。目前国内有关XRCC1 Arg399Gln基因多态性影响奥沙利铂疗效的研究主要集中在消化系统肿瘤。刘同欣等[3]报道，XRCC1 Arg399Gln基因多态性可以影响以奥沙利铂为基础的化疗方案治疗晚期胃癌患者的化疗有效率、无疾病进展生存期(mPFS)、总生存期(MST)。吴云云等[4]报道，XRCC1 Arg399Gln基因多态性分布与结直肠癌患者年龄、性别、肿瘤部位、组织病理类型、TNM分期、淋巴结转移等临床病理因素的相关性无统计学意义，但它可以影响结直肠癌患者接受含奥沙利铂辅助化疗方案治疗的PFS，进一步多因素Cox风险模型分析显示XRCC1 Arg399Gln基因多态性Gln/Arg、Arg/Arg是结直肠癌患者不良预后的独立危险因素。罗鹏飞等[7]报道，XRCC1 Arg399Gln基因多态性可以影响大肠癌肝转移患者奥沙利铂化疗后的近期疗效、无进展生存期(PFS)。尽管如此，目前XRCC1 Arg399Gln基因多态性影响奥沙利铂疗效的机制尚未完全明确，其可能机制包括如下两点[8-9]：一方面，Gln→Arg突变可以改变XRCC1蛋白的氨基酸序列，XRCC1蛋白的DNA损伤修复功能受到影响；另一方面，Gln→Arg突变可能可以促使XRCC1基因高表达，从而降低DNA损伤剂的杀细胞效应。

在本研究中，XRCC1 Arg399Gln基因型分布研究显示结肠癌患者Gln/Gln、Gln/Arg、Arg/Arg构成比分别为66.4%、27.4%、6.2%，与杨农等[10]报道相近，这说明XRCC1 Arg399Gln基因多态性分布的地域差异可能较小。由于Arg/Arg的构成比较低，如果单独列组在统计学处理时易得出假阴性结论，因此将其与Gln/Arg合并为非Gln/Gln基因型组。进一步临床资料指标比较显示，Gln/Gln基因型组与非Gln/Gln基因型组的性别、年龄、病理类型、癌肿部位、肿瘤形态、TNM分期、T分期、CEA比较差异无统计学意义(P>0.05)，这说明结肠癌患者的主要临床资料指标与XRCC1 Arg399Gln基因多态性的相关性较弱甚至无相关性。但值得注意的是，在远期疗效指标比较方面，Gln/Gln基因型组的复发转移率显著低于非Gln/Gln基因型组，3年生存率显著高于非Gln/Gln基因型组(P<0.05)。由此可见，XRCC1 Arg399Gln基因多态性可以影响结肠癌患者术后FOLFOX4辅助化疗的远期疗效，XRCC1 Arg399Gln基因多态性分析可以用于预测该方案治疗结肠癌患者的预后。

[1]仇宇，周春花，杨农，等.MTHFR基因多态性与结肠癌患者术后FOLFOX4辅助化疗疗效的关系〔J〕.肿瘤防治研究，2013，40(6)：595-598.

[2]姜健，梁军，李青芳，等.晚期胃癌病人血清XRCC1基因多态性与奥沙利铂化疗效果的相关性〔J〕.青岛大学医学院学报，2010，46(1)：19-21，25.

[3]刘同欣.晚期胃癌患者外周血XPD、XPA、XRCC1、GSTP1基因多态性对以奥沙利铂为基础的化疗方案临床疗效及生存的预测作用〔D〕.南昌大学，2011.

[4]吴云云.结直肠癌患者GSTP1、XRCC1基因多态性与奥沙利铂术后辅助化疗效果的相关性研究〔D〕. 苏州大学，2014.

[5]陈建新，乔建国.Ⅱ～Ⅲ期老年结肠癌患者行根治手术辅助化疗的预后分析〔J〕.实用癌症杂志，2015，30(6)：853-855.

[6]廖瑜倩，万以叶，彭丽香，等.XRCC1194Arg/Trp基因多态与晚期乳腺癌患者铂类方案近期疗效的相关研究〔J〕.实用癌症杂志，2012，27(6)：568-571.

[7]罗鹏飞.大肠癌肝转移患者XRCC1基因多态性与奥沙利铂疗效相关性研究〔D〕.中南大学，2011.

[8]刘龙静，李桂生，陈海辉.XRCC1单核苷酸多态性与鼻咽癌铂类化疗敏感度的相关性〔J〕.肿瘤防治研究，2015，42(7)：681-686.

[9]付婷，秦立强，潘旭东，等.XRCC1基因多态性与晚期非小细胞肺癌铂类化疗敏感性关系的Meta分析〔J〕.江苏医药，2015，41(12)：1401-1403.

[10]杨农，仇宇，王静，等.XRCC1基因多态性与结肠癌术后FOLFOX4化疗疗效相关性分析〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2013，20(22)：1736-1739.

(编辑：甘艳)

Influence of XRCC1 Gene Polymorphism on Efficacy of Postoperative Chemotherapy with FOLFOX4 for Colon Cancer

LU Hongquan，HUANG Guoding，LIN Ying，et al.

The First People’s Hospital of Danzhou，Danzhou，571700

ObjectiveTo explore the influence of X-ray cross complementing repair gene 1(XRCC1) Arg399Gln gene polymorphism on efficacy of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 for colon cancer.Methods113 cases of colon cancer were given radical operation.The XRCC1 Arg399Gln gene polymorphism in tumor tissues was detected by pyrophosphoric acid sequencing method after surgery，and all patients received 6 cycles of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4.Patients were followed up after treatment.Results⑴There were 3 kinds of allelotype of XRCC1 Arg399Gln in 113 cases of colon cancer，including Gln/Gln，Gln/Arg and Arg/Arg，and their composition ratios were 66.4%(75/113)，27.4%(31/113) and 6.2%(7/113)，respectively.⑵There had no statistical differences in gender，age，pathological type，tumor location，tumor morphology，TNM stage，T stage and cancer embryo antigen(CEA) between Gln/Gln genotype group and non-Gln/Gln genotype group(P>0.05).⑶During the follow-up，the incidence of recurrence or metastasis in Gln/Gln genotype group were statistically lower than those of non-Gln/Gln genotype group(P<0.05)，while the 3-year survival rate was significantly higher than that of non-Gln/Gln genotype group(P<0.05).ConclusionThe XRCC1 Arg399Gln gene polymorphism may affect the long-term outcome of postoperative adjuvant chemotherapy with FOLFOX4 for patients with colon cancer.

X-ray cross complementing repair gene1(XRCC1)；Gene polymorphism；Colon cancer

571700 海南省儋州市第一人民医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.08.007

R735.3+5

A

1001-5930(2016)08-1239-03

2015-12-18

2016-03-20)