激活多巴胺I类受体对氧化性低密度脂蛋白诱导的人单核细胞THP-1分泌NO/NOS的影响*

柳 磊，时 飒，李鸿珠，李 弘，徐长庆

激活多巴胺I类受体对氧化性低密度脂蛋白诱导的人单核细胞THP-1分泌NO/NOS的影响*

柳 磊，时 飒，李鸿珠，李 弘△，徐长庆△

（哈尔滨医科大学基础医学院病理生理学教研室 ，黑龙江哈尔滨150086）

目的:探讨激活多巴胺Ⅰ类受体（DR1）对氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人单核细胞（THP-1）分泌一氧化氮/一氧化氮合酶（NO/NOS）的影响及可能机制。方法:THP-1细胞经佛波酯PMA诱导分化，分为正常对照组（control），氧化型低密度脂蛋白处理组（ox-LDL），DR1激动剂干预组（SKF），DR1阻断剂干预组（SCH），ERK阻断剂干预组（PD98059）；应用油红O染色法鉴定泡沫细胞；硝酸还原法检测NO、NOS的变化情况；免疫荧光和Western blot检测各组细胞蛋白表达情况。结果:ox-LDL刺激48 h可形成泡沫细胞；DR1在THP1细胞上表达，ox-LDL刺激后，DR1蛋白表达降低（P＜0.01）；激活DR1受体能够明显抑制由ox-LDL引起的NO、iNOS增多（P＜0.01）；在MAPK阻断剂PD98059存在的情况下，SKF的作用部分丧失。结论:激活DR1受体可抑制ox-LDL引起的THP-1细胞NO的大量产生，此过程可能由ERK信号通路所介导。

多巴胺受体；巨噬细胞；一氧化氮；单核细胞；低密度脂蛋白

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.022

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脏及脑血管疾病的主要病理基础，而冠状动脉硬化性心脏病是人类死亡的首位原因［1］。其病因和发病机制十分复杂，目前认为AS是由脂质代谢紊乱引起的慢性炎症反应过程，包括内皮细胞功能不全、单核巨噬细胞、平滑肌细胞及其源性的泡沫细胞的迁移、活化、增生及炎症因子的释放等病理过程［2，3］。AS过程中所涉及的内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞皆有多巴胺受体的表达，激活多巴胺I类受体具有明显的抗氧化作用［3-6］。本研究拟在前期工作的基础上 ，以人单核细胞作为研究对象，利用ox-LDL刺激复制泡沫细胞模型，观察DR1激动剂对人单核细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人单核细胞系THP-1（American Type Culture collection）；RPMI 1640培养液、优级胎牛血清（Hyclone）；DR1阻断剂 SCH-23390、DR1激动剂SKF83959、ERK阻断剂PD98059和佛波酯PMA（Sigma）；ox-LDL（北京协生生物）；油红O试剂（北京索莱宝）；Western及 IP细胞裂解液（Beyotime）；Western Blue（Promega）；NO和NOS检测试剂盒（南京建成）；p-ERK、ERK、DR1抗体（Santa Cruz）；碱性磷酸酶标记的二抗和荧光二抗（博士德）；其他试剂均为分析纯。

1.2 泡沫细胞模型的建立及油红O染色

THP-1细胞培养在含10%胎牛血清、100 mg/ml链霉素、300mg/L谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，加入PMA（终浓度为100μg/L）诱导贴壁48 h后，更换培养液，加入ox-LDL（终浓度为50 mg/L）继续孵育48 h。弃培养液，PBS清洗3次，加入4%的多聚甲醛常温固定20min，油红O常温染色10min，再加入60%的异丙醇分化至间质清晰，PBS清洗3遍，苏木素复染，于显微镜下观察。

1.3 实验分组

正常对照组（control）:仅用PMA诱导单核细胞贴壁；氧化性低密度脂蛋白干预组（ox-LDL）:PMA诱导48 h后，加入ox-LDL，继续培养48 h；DR1激动剂干预组（SKF）:PMA诱导48 h后，加入DR1激动剂SKF83959（10 mmol/L），作用30 min，然后加入ox-LDL，继续培养48 h；DR1阻断剂干预组（SCH）:PMA诱导48 h后，先加入DR1阻断剂SCH-23390（10 mmol/L）作用30 min，再加入DR1激动剂，作用30 min，最后加入ox-LDL，继续培养48 h；ERK阻断剂干预组（PD98059）:PMA诱导48 h后，加入PD98059（10 mmol/L），作用30 min，再加入DR1激动剂作用30 min，最后加入ox-LDL，继续培养48 h。

1.4 免疫荧光检测DR1的表达情况

取培养的细胞，弃培养液，PBS清洗，4%的多聚甲醛常温固定30min；PBS清洗，0.5%Triton-100常温孵育30min，PBS清洗，羊血清37℃湿盒封闭1 h，DR1兔IgG一抗（1∶50）4℃孵育过夜，PBS清洗，荧光二抗（1∶100）避光常温孵育1 h，PBS清洗，DAPI染核，PBS清洗，荧光显微镜下观察并摄片。

1.5 NO和NOS含量检测

取各组经ox-LDL刺激48 h的细胞培养液，每组8个孔（每孔5×105cells），按照试剂盒说明书，运用紫外分光光度计测定吸光度（OD）值，通过相应的计算公式，计算培养液中一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的含量；培养细胞经胰酶消化后细胞计数；计算细胞分泌NO 和NOS的含量。

1.6 蛋白质免疫印迹检测相关蛋白的表达

取各组培养细胞，PBS洗涤，加入全细胞裂解液，冰上处理10min，4℃，12 000 r/min离心20min，取上清进行蛋白质定量。取40μg总蛋白样品于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印至PVDF膜，用10%无脂肪牛奶封闭后，用兔IgG一抗（1∶500）4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记二抗（1∶500）室温孵育1 h，最后用western blue stabilized substrate for AP（Promega）显色，光密度扫描半定量分析显影条带。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 ox-LDL刺激THP-1细胞泡沫化

单纯PMA诱导的THP-1细胞，胞浆内未见红色颗粒；而ox-LDL刺激48 h的THP-1细胞，大部分胞浆内出现红色的脂质颗粒（图1）。

Fig.1 Lipid aggregation in THP-1 cells induced by ox-LDL（Oil Red O staining×400）

2.2 ox-LDL刺激THP-1细胞DR1蛋白表达降低

免疫荧光结果显示，THP-1细胞存在DR1的表达，主要存在于细胞膜和细胞质中（图2A）；Westernblot检测也显示DR1的蛋白表达（图2B）；经过ox-LDL诱导48 h后，与对照组相比，DR1表达降低（P ＜0.01，图2B）。

2.3 DR1激活可以抑制ox-LDL诱导的THP-1细胞NO和NOS的产生

与正常对照组相比，经ox-LDL刺激后，THP-1细胞分泌到培养液中的NO、tNOS和iNOS均增多（P ＜0.01）；DR1激动剂预处理后，能明显抑制NO（P ＜0.05）、tNOS和iNOS的增多（P＜0.01）；DR1阻断剂预处理后，与ox-LDL组相比，NO、tNOS和iNOS分泌没有明显变化；ERK阻断剂预处理后，与单纯DR1激动剂处理组相比，NO，tNOS和iNOS有所增多（P ＜0.05，表1）。

Fig.2 Expression of dopamine receptor（DR1）in THP-1 cellsA:Protein expression of DR1 in differentiated THP-1 cellswas detected by immnunofluorescence staining（×400）；B:Protein expression of DR1 in differentiated THP-1 cells

Tab.1 Contentof NO/NOS in the supernatantof THP-1 cell（±s，n=8）

Tab.1 Contentof NO/NOS in the supernatantof THP-1 cell（±s，n=8）

ox-LDL:Oxidized low density lipoprotein；SKF:DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；SCH:DR1 antagonitSCH23390+DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；PD98059:ERK antagonit PD98059+ DR1 agonist SKF83959+ox-LDL**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ox-LDL group；△P＜0.05 vs SKF group

Group　NO（μmol/L）　tNOS（U/ml）　iNOS（U/ml）Control　12.642±2.073　5.486±0.757　3.455±0.172 ox-LDL　21.014±4.270**7.345±1.311**5.143±1.047**SKF　15.133±2.229#　5.663±0.793##4.001±0.145##SCH　19.219±3.521　7.076±1.362　5.279±0.145 PD98058　18.841±3.521△　6.677±1.362△4.742±0.634△

2.4 p-ERK和ERK蛋白的表达

Western blot结果显示，与正常对照组相比，低密度脂蛋白处理后，p-ERK表达明显减少（P＜0.01，图3）；经过DR1激动剂预处理后，与ox-LDL组相比，p-ERK表达增多（P＜0.05）；DR1阻断剂预处理后，p-ERK表达降低；使用ERK阻断剂并没有影响p-ERK的表达水平。

Fig.3 The expression of p-ERK/ERK in THP-1 cells（n=8）ox-LDL:Oxidized low density lipoprotein；SKF:DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；SCH:DR1 antagonit SCH23390+ DR1 agonist SKF83959+ox-LDL；PD98059:ERK antagonit PD98059+DR1 agonist SKF83959+ox-LDL

3 讨论

动脉粥样硬化是多种因素共同参与的慢性炎症过程，病变的各个阶段都伴有大量炎细胞的浸润，而单核巨噬细胞的异常是引发和促进动脉粥样硬化的关键因素，因此针对其黏附、聚集、胆固醇代谢，炎症活动的研究已成为近年来AS的研究热点［2］。脂类代谢异常尤其是低密度脂蛋白增多是AS的首位危险因素。巨噬细胞通过吞噬大量氧化修饰的低密度脂蛋白（ox-LDL），转化成细胞内脂质堆积的泡沫细胞，进而形成脂质条纹乃至脂质斑块［7］。本实验通过ox-LDL刺激THP-1细胞，复制AS的细胞模型，结果显示，经过48 h的ox-LDL孵育，大部分细胞内可见染成红色的脂滴，提示使用该模型研究AS是可行的。

ox-LDL刺激的巨噬细胞会产生大量炎性介质和活性氧，而氧化应激可引起内皮细胞损伤，促进平滑肌细胞增殖迁移，加速AS的进程［8，9］。适量的NO具有重要的生理功能，过量则具有毒性作用，引起细胞损伤，加重炎性反应［6］。本实验证实ox-LDL刺激的巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶（（iNOS）增多，产生和分泌大量NO，引起氧化应激，因此降低NO的水平将会抑制AS的进程。

多巴胺受体属于G蛋白偶联受体超家族成员，根据生化和药理学特性的不同，将其分为D1样和D2样受体，其中D1与G蛋白中Gs结合，激活腺苷酸环化酶（AC），使cAMP增高，刺激磷脂酶C，导致细胞内钙增高。D2样受体与Gi/Gq作用，抑制AC，降低cAMP，抑制钙通道，调节钾通道［10］。研究显示，在血管平滑肌细胞中，多巴胺发挥抗氧化作用主要通过DR1［3-4］。巨噬细胞上存在多巴胺受体，激活DR1可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞增生［11］，但DR1在此过程中是如何发挥作用并不清楚。

本课题组前期实验已证实，小剂量的多巴胺通过DR1能够抑制过氧化氢诱导的心肌细胞的损伤，具有抗氧化作用［6］。本实验结果显示，THP-1细胞的胞浆和细胞膜上存在DR1表达，但经ox-LDL刺激后表达降低，提示其可能参与了泡沫细胞的形成。使用DR1激动剂预处理后，细胞生成的NO明显减少，说明DR1激动剂能够抑制由ox-LDL诱导的NO增多。为了进一步探讨其介导的信号转导通路［12］，选择ERK阻断剂PD98059，可见多巴胺受体激动剂的作用受到抑制，说明DR1激活介导的抗氧化作用与ERK通路有关，具体机制还有待进一步探讨。

综上所述，氧化性低密度脂蛋白对细胞有损伤作用，激活DR1受体可抑制ox-LDL引起的THP-1细胞NO的大量产生，此过程可能通过ERK信号通路所介导。

［1］Rice BH.Dairy and cardiovascular disease:a review of recent observational research［J］.Curr Nutr Rep，2014，3: 130-138.

［2］Legein B，Temmerman L，Biessen EA，et al.Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis［J］.Cell Mol Life Sci，2013，70（20）:3847-3869.

［3］YasunariK，KohnoM，Kano H，etal.Dopamine asa novel antioxidative agent for rat vascular smooth muscle cells through dopamine D（1）-like receptors［J］.Circulation，2000，101（19）:2302-2308.

［4］Zeng C，Han Y，Huang H，et al.D1-like receptors inhibit insulin-induced vascular smoothmuscle cell proliferation via down regulation of insulin receptor expression［J］.JHypertens，2009，27（5）:1033-1041.

［5］杨 迪，韩 愈，寇 恂，等.多巴胺D1类受体在小鼠巨噬细胞上的表达及其对ox-LDL诱导的小鼠巨噬细胞增殖的影响［J］.第三军医大学学报，2014，36 （1）:11-14.

［6］蔡晓娜，时 飒，李鸿珠 ，等.小剂量多巴胺对氧化应激诱导的大鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制［J］.中国应用生理学杂志，2015，31（1）:67-71.

［7］Yu XH，Fu YC，Zhang DW，etal.Foam cells in atherosclerosis ［J］.Clin Chim Acta，2013，424:245-252.

［8］Huang H，Koelle P，Fendler M，et al.Induction of inducible nitric oxide synthase（iNOS）expression by oxLDL inhibitsmacrophage derived foam cellmigration［J］.Atherosclerosis，2014，235（1）:213-222.

［9］Raman KG，Gandley RE，Rohland J，et al.Early hypercholesterolemia contributes to vasomotor dysfunction and injury associated atherogenesis that can be inhibited by nitric oxide ［J］.JVasc Surg，2011，53（3）:754-763.

［10］Vallone D，Picetti R，Borrelli E.Structure and function of dopamine receptors［J］.Neurosci Biobehav Rev，2000，24 （1）:125-132.

［11］李 帅 ，黄 健，李红艳，等 .NO/PKG对THP-1巨噬细胞ABCA1基因mRNA表达和胆固醇含量的影响［J］.临床心血管病杂志，2011，27（10）:791-794.

［12］王媛媛 ，彭 洋 ，张 琦，等.ERK1/2信号通路对黄芪苷Ⅳ抗H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤的作用［J］.中国应用生理学杂志，2011，27（3）:363-366.

Effects of activation of dopam ine type I receptor on the production of NO/NOS in ox-LDL activated THP-1 cells

LIU Lei，SHISa，LIHong-zhu，LIHong△，XU Chang-qing△
（Department of Pathophysiology，Harbin Medical University，Harbin 150086，China）

【ABSTRACT】Objective:To study the effectof excited dopamine type Ireceptoron the production ofnitric oxide/nitric oxide synthase（NO/ NOS）in ox-LDL activated THP-1 cells and the possiblemechanism.Methods:Cultured THP-1 cellsactivated by PMAwere random ly assigned in the following groups:control group（control），oxidized low density lipoprotein group（ox-LDL），dopamine receptor 1（DR1）agonistgroup （SKF），DR1 antagonistgroup（SCH），ERK blocker group（PD98059）.Oil Red O stainingwas used to identify the accumulation of cellular lipid.The levels of NO and NOS in the supernatantof THP-1 were assayed by nitrate reductasemethod.The protein expression of DR1，p-ERK and ERK were obtained byWestern blotand immunity fluorescence.Results:After48 h of incubation ofox-LDL，accumulation of lipid in the cytoplasm was found inmost THP-1 cells.Compared with control group，DR1 protein expressionwas reduced in ox-LDL-induced cells （P＜0.01）.Activation of DR1 agonist decrease the production of NO and iNOS（P＜0.01），and PD98059 partly reversed the above effect. Conclusion:Activation of DR1 can inhibit the production of NO/NOS in ox-LDL-induced THP-1 cells，whichmay be relatedwith ERK pathway.

dopamine receptor（DR）； foam cells； nitric oxide（NO）； THP-1 cells； LDL

R363.2

A

1000-6834（2016）03-274-04

黑龙江省自然科学基金项目资助（D200880）；黑龙江省教育厅课题（12521181）

2015-03-09

2015-10-20

Tel:0451-86674548；E-mail:drlihong1971@163.com