SATB1在人不同前列腺癌细胞系中表达的实验研究

韩阳军　王冰　蒙学冰　刘红雷　谷亚明　张明华　刁英智　黄伟超　佟明

[摘要]目的：探讨SATB1与前列腺癌增殖及侵袭发生的关系。方法：体外培养前列腺癌细胞系（LNCaP、PC3、DU145），MMT法检测其增殖能力；Tanswell细胞侵袭实验检测其侵袭能力；RT-PCR检测其SATB1 mRNA的表达情况；Western blot检测其SATB1蛋白质的表达。结果：前列腺癌细胞PC3和DU145的增值能力及侵袭能力比LNCaP强（P<0.01），PC3和DU145细胞中SATB1 mRNA及蛋白质表达水平均显著高于LNCaP细胞（P<0.01）。结论：SATB1在前列腺癌表达水平可能与前列腺癌的增殖和侵袭正相关。

[关键词]SATB1；前列腺癌；LNCaP；PC3；DU145

[中图分类号]R737.25 [文献标志码]A

随着我国人口的老龄化、饮食结构和生活方式的改变，以及诊断水平的提高，前列腺癌在国内发病率与相关死亡人数也在逐年上升，在我国男性恶性肿瘤发病率排名中居第六位：死亡率在所有男性恶性肿瘤中排第九位。前列腺癌对人类健康的威胁变得越来越严重，已成为影响我国男性，尤其是50岁以上男性健康的一个重要因素。SATB1（special AT rich sequencebinding protein 1）是一种组织特异性表达的核基质结合蛋白（matrix attachment regions binding protein），在胸腺细胞和前B细胞之中显著表达，其次是造血干细胞和神经干细胞，在其他细胞中很少表达。研究发现SATB1与乳腺癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、黑索瘤、膀胱癌、肾癌等肿瘤的发生及转移有关。我们前期的研究发现SATB1在前列腺癌中高表达，且其与病理分级、临床分期密切相关。本研究通过比较不同前列腺癌细胞系（LNCaP、PC3和DU145）之间的增殖与侵袭能力及其与SATB1基因和蛋白质表达情况，探讨SATB1在前列腺癌增殖及侵袭中的作用，为前列腺癌的诊断、治疗寻找一个可能的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人前列腺癌细胞株LNCaP、PC3和DU145购自中国医学科学院基础医学研究所细胞研究中心。

1.1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclon公司：胰蛋白酶、DMSO（二甲基亚砜）和Hochest33258购自美国Sigma公司；MTT（四甲基偶氮唑盐）购自北京中杉公司；3422 Transwell购自美国Coming公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒、Wide RangeDNA Marker、TaqDNA聚合酶均购自日本Takara公司；羊多抗SATB1购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 LNCaP、PC3、DU145细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基（青链霉索各100U/mL）中，于37℃、5%C02饱和湿度下培养箱内常规培养，每48h换液一次，细胞密度达80%时，按1：2或1：3进行传代。

1.2.2 实验方法 1.2.2.1 噻唑蓝（MTI"）比色法测定检测LNCaP、PC3、DU145细胞增殖能力 将生长状态良好的上述3种细胞，制备单细胞悬液，按每孔10³个细胞接种于96孔细胞培养板中，每组设4个复孔，分别将3种细胞培养至24h、48h、72h；每孔中加入预先配制好的MTT试剂20μL，37℃继续孵育4h，弃孔内培养液，然后每孔加二甲亚砜（DMSO）150μL混合均匀在酶联免疫检测仪上570nm波长处检测各孔吸光度值（A），记录结果，取均值，以时间为横轴，光吸收值（A）为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.2.2.2 Tanswell细胞侵袭试验检测LNCaP、PC3、DU145细胞的侵袭能力 将Corning3422 TransweH培养板提前一天用Fi-bronectin包被过夜：取上述3组的细胞，胰酶消化后用FBS 5%的RPMI 1640培养基悬浮；以2×10⁵/mL的细胞密度接种至上面的小室中，每孔100μL，下室加入600μL含FBS 10%的RPMI1640培养基中，每种细胞4个复室；培养24h后用Hochest33258避光染色，以穿过Transwell小室的细胞数量，作为评价侵袭能力的指标。荧光显微镜下观察计数，每张片取4个视野，记录数值。

1.2.2.3 RT-PCR检测LNCaP、PC3、DU145细胞SATB1 mR-NA的表达 Tfizd法提取细胞的总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；取RNA逆转录合成cDNA；GenBank获取人SATB1 mRNA全序列（GenBank ACCESSION：NM_002971）、人β-actin mRNA全序列（GenBank ACCESSION：NM_001101）利用Primer5.0软件，设计引物。SATB1上游引物：5/-TGATGGCTCAGCTGCTGAAC-3/，下游弓l物5/-GGGAGGACGGCTGGGTGGTGT-3/，β-actin上游引物：5/-ATCATGTTTGAGACCTYCAACA-3/下游引物：5/-AGGTAGTCAGTCAGGTCCCGG-3/。RNA反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min；重复30个循环；72℃终延伸5min。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，应用GSG2002核酸，蛋白凝胶图像分析管理系统进行灰度测量，以每一样品与其内参β-actin的比值代表该样品PCR产物的相对含量。

1.2.2.4 Western blot检测 LNCaP、PC3和DU145细胞SATB1蛋白质水平以细胞裂解液裂解筛选后的细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白的浓度，制备SDS-PAGE胶，每泳道加入10μg总蛋白，电泳。将蛋白质转移到硝酸纤维（NC）膜，用0.01M PBS洗膜，加入包被膜，室温2h；加入一抗（羊抗人多克隆抗体SATB1），4℃放置12h；弃一抗，用0.01M PBS洗膜；加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1：2000），室温2h；弃二抗，0.01M PBS洗膜，加入显色液，干燥后行条带扫描和利用凝胶自动分析成像软件Chem image 5500对蛋白条带进行分析。

1.2.3 统计学处理 所有数据均以（x±s）表示，统计学处理采用方差分析、q检验，采用SPSS11.5统计软件进行统计分析。P>0.05认为差异无统计学意义，P≤0.05认为差异具有显著统计学意义，P<0.01认为差异具有极显著统计学意义。

2 结果

2.1 LNCaP、PC3和DU145细胞增殖能力

人前列腺癌细胞PC3和DU145每24h的细胞生长速度均比较LNCaP细胞快，增殖能力比LNCaP细胞强（P<0.01），PC3和DU145细胞之间没有统计学差异（P>0.05）。见表1和图1。

2.2 LNCaP、PC3和DU145细胞侵袭能力

以穿过Transwell小室模拟基底膜的细胞数来表示细胞的侵袭能力，3种细胞24h后穿透涂Matrigel胶基底膜的细胞数是：PC3（33.00±3.52）、DU145（30.67±4.19）、LNCaP（5.16±1.11），PC3和DU145穿过膜的细胞数明显多于LNCaP细胞（P<0.01），而人前列腺癌细胞PC3和DU145穿过膜的细胞数没有统计学差异（P>0.05）。见图2。

2.3 LNCaP、PC3和DU145细胞SATB1 mRNA表达情况

LNCaP、PC3和DU145细胞总RNA以琼脂糖凝胶电泳鉴定（见图3），28S：18S=2：1，无DNA条带的污染，RNA的完整性较好，无降解。经紫外分光光度法评定，OD260nm/OD280nm比值均在1.8-2.0之间，表明RNA的纯度较高，可用于PCR扩增。3种细胞均有SATB1 mRNA表达，片段大小为452bp，与预计结果一致；各样本β-actin对照均在相应位置203bp处出现明显的扩增条带，表明RT—PCR过程良好（图4）。SATB1 mRNA在PC3与DU145中的表达高于LNCaP细胞，其差异具有极显著统计学意义（P<0.01），而PC3与DU145之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）（图5）。

2.4 SATB1蛋白质在PC3、DU145与LNCaP细胞中的表达情况

在相对分子量115kDa附近，PC3、DUl45与LNCaP细胞均有阳性条带，与预期结果一致。图6、图7显示SATB1蛋白质在PC3、DU145细胞中的表达高于LNCaP细胞（P<0.01），而PC3与DU145细胞之间的差异不具有统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

本次研究，我们选用了LNCaP、PC3和DU145三种人前列腺癌细胞株。LNCaP细胞为雄激素依赖型前列腺癌细胞株，PC3和DU145是雄激素非依赖性前列腺癌细胞株，均为发生前列腺外转移的细胞株。无限性增殖是肿瘤细胞的基本特征，也是肿瘤侵袭、转移的基础和前提，随着细胞的增殖导致肿瘤组织内部压力增高，这种扩张性的压力有利于癌细胞向压力低的方向侵袭和转移。我们用MTr法检测三种前列腺癌细胞株的增殖生长情况，结果显示PC3、DU145细胞的增殖能力比LNCaP细胞强（P<0.01），而PC3和DU145细胞之间差异没有统计学意义（P>0.05），与Engl等的实验结果相似。Tanswell细胞侵袭实验是目前体外研究肿瘤细胞侵袭行为的最经典方法。本次我们利用这种实验检测3种人前列腺癌细胞株的侵袭能力，结果显示人前列腺癌PC3和DU145穿膜细胞数多于LNCaP细胞（P<0.01），而PC3、DU145穿膜细胞数差异不具有统计学意义（P>0.05），表明PC3和DU145细胞的侵袭能力高于LCaP细胞，与以往体内、体外实验研究结果一致。这可能与雄激素依赖性前列腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌的临床特性相关。前列腺癌临床上早期多为激素依赖性的，中晚期或复发后的前列腺癌大都获得了激素非依赖性生长和多药耐药的特性，且多发生远处器官的转移，导致常规治疗的失败，患者病死率高。

SATB1通过限定多个基因组的位点和补充染色质修饰酶来调节染色质的结构和基因的表达。我们用RT-PCR和Western Blot检测SATB1在PC3、DU145和LNCaP细胞中的表达，经方差分析实验结果发现SATB1 mRNA和蛋白在人前列腺癌细胞PC3、DU145和LNCaP中的表达水平不尽相同（P<0.01），采用多样本均数间的两两比较q检验分析，PC3和DU145细胞中的表达水平高于LNCaP细胞，其差异具有极显著统计学意义（P<0.01），而PC3与DU145之间的差异没有统计学意义（P>0.05），说明SATB1 mRNA和蛋白在不同的前列腺癌细胞中表达水平不同。本次研究与其他学者的研究结果相似。国外学者Han等对乳腺癌的一项研究表明SATB1蛋白是乳腺癌细胞获得转移性所必需的，其在具有侵袭性的乳腺癌细胞中有所表达，而在正常细胞中并不出现。SATB1 mR-NA的表达可能与非小细胞肺癌的发生和淋巴转移有关。体外、体内研究发现通过抑制SATB1的表达，可以抑制前列腺癌的生长和转移。在具有较强侵袭性的癌细胞中敲除SATB1基因，可以改变肿瘤细胞的极性而逆转肿瘤的发生，抑制肿瘤的生长和转移。我们本次实验发现SATB1在人前列腺癌细胞PC3、DU145中的表达高于LNCaP，而且人前列腺癌细胞PC3、DU145的增殖及侵袭能力强于LNCaP，表明SATB1的表达可能与前列腺癌的增殖及侵袭性呈正相关。

随着对前列腺癌机制研究的逐步深入和对SATB1结构和功能认识的提高，我们可能借助于检测SATB1在前列腺癌中的表达，评估前列腺癌的预后，同时我们也有可能通过以SATB1为作用靶点寻找到一种新型高效的治疗前列腺癌途径。

（收稿日期；2015-07-20）