自发性高血压大鼠心肌组织Ets-1及CTGF的表达变化及意义

郝广华， 韩振华， 袁海峰， 靳耀锋， 高登峰， 董　新

(1西安交通大学医学院第二附属医院心内科，西安　710004； 2西安交通大学医学院第二附属医院脑病科； 3西安交通大学医学院第二附属医院病理科；*通讯作者，E-mail: guanghua-h@163.com)



自发性高血压大鼠心肌组织Ets-1及CTGF的表达变化及意义

郝广华1*， 韩振华1， 袁海峰2， 靳耀锋3， 高登峰1， 董新1

(1西安交通大学医学院第二附属医院心内科，西安710004；2西安交通大学医学院第二附属医院脑病科；3西安交通大学医学院第二附属医院病理科；*通讯作者，E-mail: guanghua-h@163.com)

目的研究自发性高血压大鼠(SHR)心肌组织转录因子Ets-1及其下游结缔组织生长因子(CTGF)的表达，探讨其与心室重构的关系。方法16、32周龄Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和16、32周龄SHR。采用称重方法测定心脏重量/体重，尾套测压法测量各组大鼠尾动脉收缩压(SBP)，Masson染色观察左心室胶原沉积，实时定量RT-PCR及免疫组织印迹方法检测左心室Ets-1及CTCF的表达。结果与同周龄WKY大鼠相比，SHR的SBP及心脏重量/体重显著升高(P<0.05)，左心室胶原纤维沉积明显增多，左心室Ets-1及CTGF mRNA及蛋白表达水平均显著增高(均P<0.05)，且32周龄SHR左心室Ets-1及CTGF mRNA表达及蛋白表达水平高于16周龄SHR。结论随着SHR周龄的增加、SBP的升高和心室重构的加重，其左心室Ets-1及CTGF显著增高。提示Ets-1可能是参与调控心室重构的一个重要因子。

自发性高血压；心室重构；Ets-1；结缔组织生长因子

高血压的流行已经是威胁公众健康的重大问题。高血压诱发的心室重构以心肌细胞肥大及成纤维细胞增殖、胶原及细胞外基质沉积为主要特征，可导致心脏收缩及舒张功能障碍，是心力衰竭的病理基础，与心律失常、猝死以及心力衰竭的发生发展密切相关，因此是心脏事件的独立危险因素[1]。

转录因子Ets-1属于Ets (E-twenty-six)转录因子家族，在细胞增殖、分化、凋亡、代谢及组织重塑等多种生物学过程中发挥着重要效应。其主要通过调节一些编码细胞外基质成分及与基质降解有关的酶类等基因的表达参与组织重塑过程[2,3]。我们近期的一项研究提示Ets-1参与调控血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)诱发的心脏成纤维细胞增殖、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)合成及释放，从而参与了心肌纤维化病变[4]。本实验拟以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)为研究对象，观察其左心室组织Ets-1及CTGF的表达情况，探讨其在高血压心室重构中的作用。

1　材料及方法

1.1实验动物

24只不同周龄SHR和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005。将动物分为WKY(16,32周)组和SHR(16,32周)组，每组6只。动物饲养于室温23 ℃左右，12 h明暗交替的环境中，允许自由饮食。所有实验操作已得到西安交通大学医学院动物伦理委员会批准。

1.2主要试剂

兔抗Ets-1多克隆抗体、生物素化山羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz公司。兔抗CTGF多克隆抗体购自英国ABCAM公司。SYBR ExScriptTMRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司。

1.3大鼠血压测量及心肌组织标本采集

各组大鼠称重并测血压，采用尾套测压法测量尾动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)，取3次测量的平均值。经水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mg/kg)后，打开胸腔，迅速分离并取出心脏，投入预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)液中，洗净残血并去除大血管，称重后去除心房及右心室，沿垂直于心脏长轴方向将左心室分为两部分，一部分放入4%多聚甲醛液固定，石蜡包埋；另一部分分为数块投入液氮中保存，用于组织mRNA及总蛋白的提取。

1.4左心室胶原纤维 Masson染色

4%多聚甲醛固定液固定组织，石蜡包埋切片，厚度为5 μm，常规脱蜡至水，置Masson复合染液中8 min，0.2%醋酸水溶液清洗2次，再置入1%磷钨酸中15 min，0.2%醋酸水洗2次，至亮绿染液40 s，0.2 %醋酸水溶液清洗2次，滴度酒精脱水；二甲苯透明，中性树胶封片。倒置显微镜下观察，胶原纤维呈绿色，心肌纤维呈红色。

1.5实时定量RT-PCR检测Ets-1及CTGF mRNA表达

用TRIzol试剂提取心肌组织总RNA，测定260 nm和280 nm处的吸光度(OD)，计算RNA浓度；按SYBR ExScriptTMRT-PCR试剂盒说明进行逆转录。GAPDH引物序列为：上游 5′-GCC TTC TCC ATG GTG GTG AA-3′；下游 5′-GGT CGG TGT GAA CGG ATT TG-3′；扩增产物长度为309 bp。Ets-1引物序列为：上游 5′-TGA TGT GGG CTG TGA ATG AG-3′；下游 5′-TGA AGT AAT CCG AGG TGT AAC G-3′；扩增产物长度为262 bp。CTGF引物序列为：上游 5′-AAG AAG ACT CAG CCA GAC C-3′；下游 5′-AGA GGA GGA GCA CCA AGG-3′，扩张片段长度为260 bp。按实时定量PCR试剂盒说明构建PCR反应体系后采用ABI PRISM 7000 sequence detection PCR system在下述条件扩增：94 ℃预变性10 s；进入循环，95 ℃ 5 s，60 ℃退火、延伸31 s，共45个循环。每样本做3个复管。用ABI primer 7000 SDS软件求出各样本的CT值，以2-ΔΔCt法计算各组RNA表达与正常对照比较的Folds值。

1.6免疫印迹检测 Ets-1及CTGF蛋白表达

用裂解液(RIPA)裂解组织后提取总蛋白，采用 BCA法测定蛋白含量。稀释蛋白样品为10 μg/μl，加入上样缓冲液后煮沸10 min后离心，进行8% SDS-PAGE凝胶电泳并电转至PVDF膜上，封闭缓冲液封闭1 h，分别滴加兔抗大鼠Ets-1抗体(1∶200)、兔抗大鼠CTGF抗体(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶200)，4 ℃孵育过夜，生物素化山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化学发光试剂中反应1-3 min；常规方法显影定影，拍照后采用Gel Doc 2000系统行拍照及灰度分析。

1.7统计学分析

2　结果

2.1大鼠体重、收缩压和心脏重量/体重变化

与同周龄WKY组相比，16及32周龄SHR组的收缩压显著增加(P<0.05，见表1)，且随周龄的增加，SHR的血压呈明显升高趋势，由16周的(134.9±9.0)mmHg升至32周的(153.7±13.3)mmHg。16周及32周SHR大鼠的心脏重量/体重也较同周龄WKY明显增加(P<0.05)，32周SHR的心脏重量/体重明显高于16周龄SHR。

表1大鼠的体重、收缩压和心脏重量/体重

Table 1Comparison of body weight, SBP, heart weight/body weight between SHR and WKY rats

周龄组别体重(g)收缩压(mmHg)心脏重量/体重(mg/g)16周WKY351.8±16.3103.2±4.33.2±0.1SHR287.1±18.6134.9±9.0*4.1±0.1*32周WKY439.3±18.1104.5±5.23.2±0.1SHR363.9±10.7153.7±13.3*4.5±0.1*

与同周龄WKY大鼠相比，*P<0.05

2.2大鼠左心室胶原含量变化

Masson 染色可见SHR的心肌细胞肥大，心肌间质及血管旁蓝绿色的胶原纤维组织明显增多，排列紊乱(见图1)，且随周龄增加，胶原染色明显增加。WYK组心肌间隙清晰可见，胶原纤维分布稀疏，着色淡。胶原纤维染色在不同WKY周龄组间变化不明显。

2.3大鼠左心室Ets-1及CTGF mRNA表达

实时定量RT-PCR结果表明，与同周龄WKY组相比，SHR组左心室心肌组织Ets-1及CTGF mRNA表达水平显著增高(P<0.05)，且32周 SHR左心室Ets-1及CTGF mRNA表达高于16周SHR。不同周龄WKY组大鼠心肌细胞Ets-1及CTGF表达无明显变化(见图2)。

A.16周WKY组　　　　　B.32周WKY组　　　　　C.16周SHR组　　　　　D.32周SHR组图1　各组大鼠心肌胶原染色 (Masson，×200)Figure 1　Masson staining of left ventricular collagen fiber of rats (×200)

A.Ets-1 mRNA表达　　　　　　　　　　　　　B.CTGF mRNA表达与同周龄WKY大鼠相比，*P<0.05图2　实时定量RT-PCR示各组大鼠心肌组织Ets-1 及CTGF mRNA的表达Figure 2　 Real-time RT-PCR analysis of Ets-1 and CTGF mRNA levels in left ventricle of rats

2.4大鼠左心室Ets-1及CTGF蛋白的表达

采用免疫印迹实验方法观察各组大鼠左心室心肌组织中Ets-1及CTGF蛋白的表达水平。如图 3所示，SHR的心肌组织中Ets-1蛋白的表达显著高于同周龄WKY组(P<0.05)。且32周 SHR的Ets-1蛋白表达较16周者增高。大鼠左心室CTGF蛋白的表达变化同Ets-1变化一致(见图4)。

3　讨论

高血压心室重构对心脏的收缩及舒张功能起决定性作用，介导该结构变化的关键因素仍未完全阐明。Ang Ⅱ作为肾素-血管紧张素系统的主要效应分子，通过激活其Ⅰ型受体(AT1)，促进心肌细胞及心脏成纤维细胞增殖、分化、合成和分泌大量细胞外基质蛋白，及促纤维化因子如CTGF，在心室重构中具有极其重要的作用[5]。

研究证实，多种组织的纤维化重构过程可诱导Ets-1过表达。Ets-1又可进一步调控一些编码细胞外基质成分的重要基因以及与基质降解密切相关的酶类的表达[6,7]。这些研究提示，Ets-1可能是介导组织重构的一个重要因子。在本研究中，随着SHR血压的升高以及心肌肥厚的发展，Ets-1的mRNA及蛋白表达持续升高。提示Ets-1可能参与了高血压心室重构的病理过程。既往亦有研究证实，Ets-1参与Ang Ⅱ诱发的肾脏纤维化[2]、TNF-α诱导的支气管成纤维细胞 MMP-9 的表达[8]、以及肝脏星状细胞的活化[9]，从而参与多种组织的纤维化及修复过程。我们近期的研究表明在大鼠心脏成纤维细胞中，Ang Ⅱ通过AT1受体介导，激活PKC、ERK及JNK等信号转导通路，从而诱导Ets-1基因的表达[4]。据此我们推测，SHR心肌组织中Ets-1表达的增高，可能也与上述信号转导机制有关。当然，压力负荷及其他促纤维化因子如TGF-β对心肌组织Ets-1的表达调节需要进一步研究来阐明。

图3　免疫印迹方法示各组大鼠左心室Ets-1蛋白的表达Figure 3　Western blot analysis of Ets-1 protein levels in left ventricle of rats

图4　免疫印迹方法示各组大鼠左心室CTGF蛋白的表达Figure 4　Western blot analysis of CTGF protein levels in left ventricle of rats

CTGF属于生长因子CCN家族成员。其在成纤维细胞中表达且参与触发多种促纤维化的细胞过程。近期研究显示，心脏成纤维细胞中CTGF表达的上调是Ang Ⅱ诱发心脏重塑的一个重要介导因素[10]。而且，Ets-1可通过结合于CTGF启动子的Ets-1结合序列而诱发CTGF的表达，表明CTGF也是Ets-1的下游靶基因[11]。在本实验中，SHR肥厚的左心室组织Ets-1表达上调，同时伴随着CTGF表达的上调。提示Ets-1可能参与调节CTGF的促心室重构作用。我们近期的研究表明，转录因子Ets-1通过参与调控心脏成纤维细胞增殖、CTGF等促组织纤维化因子的表达。从而可能介导了心肌重构过程[4]。

综上所述，本研究表明随着SHR周龄的增加、血压的升高及心肌纤维化的加重，其左心室Ets-1及CTGF显著升高。提示Ets-1可能是心肌纤维化过程的一个重要介导因素。本研究结果为进一步揭示心室重构这一病理过程提供了实验依据。

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Myocardial expression of Ets-1 and CTGF in spontaneously hypertensive rats and its relationship with cardiac remodeling

HAO Guanghua1*, HAN Zhenhua1, YUAN Haifeng2, JIN Yaofeng3, GAO Dengfeng1, DONG Xin1

(1DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Xi’an710004,China;2DepartmentofEncephalopathy,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine;3DepartmentofPathology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine;*Correspondingauthor,E-mail:guanghua-h@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Ets-1 and connective tissue growth factor(CTGF) in left ventricle of spontaneously hypertensive rats(SHR), and to explore the role of Ets-1 in cardiac remodeling.MethodsDifferent age of Wistar-Kyoto(WKY) rats and SHR were divided into WKY(16, 32 weeks old) groups, SHR(16, 32 weeks old) groups. Systolic blood pressure(SBP) of rats was measured by tail cuff method. The ratio of heart weight to body weight was measured. Left ventricular fibrosis was detected by Masson staining. The expression levels of Ets-1 and CTGF mRNA and protein were analyzed by real-time RT-PCR and Western blot, respectively.ResultsIn comparison with WKY rats with the same age, SBP and the ratio of heart weight to body weight were significantly raised in SHR(P<0.05), left ventricular fibrosis in SHR was increased, and the mRNA and protein expression levels of Ets-1 and CTGF were increased(P<0.05). The expression levels of CTGF mRNA and protein were significantly higher in 32-weeks-old SHR than in 16-weeks-old SHR.ConclusionTranscriptional factor Ets-1 is a potential mediator in cardiac remodeling of hypertension.

spontaneous hypertension;cardiac remodeling;Ets-1;connective tissue growth factor

国家自然科学基金资助项目(30900693)；陕西省社会发展科技攻关基金资助项目(2015SF021)

郝广华，女，1978-05生，博士后，主治医师，E-mail：guanghua-h@163.com.

2016-01-23

R544.1

A

1007-6611(2016)03-0195-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.001