白藜芦醇对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的影响

刘英博，付 越，郝 璐，李敬双，于 洋（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001）

白藜芦醇对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的影响

刘英博，付 越，郝 璐，李敬双，于 洋*
（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁锦州121001）

研究了白藜芦醇（Res）对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的影响。无菌分离小鼠脾，制备淋巴细胞，并用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养，在培养液中分别加入刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖（LPS）以及5、10、20、40 μg/mL不同浓度的Res，经过不同时间培养后，采用MTT法检测淋巴细胞的增殖，ELISA法检测淋巴细胞分泌IL-4和IL-12的水平，流式细胞仪检测淋巴细胞的细胞周期和细胞膜表面标志。结果表明：Res能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖，能与ConA协同促进小鼠脾淋巴细胞增殖，不能与LPS协同促进小鼠脾淋巴细胞增殖；能增强IL-4和IL-12的分泌；能提高小鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值；能提高脾淋巴细胞周期中细胞进入S期细胞的百分率。综上，Res能增强小鼠脾淋巴细胞的免疫调节活性。

白藜芦醇，淋巴细胞，增殖，细胞因子，细胞周期，细胞膜表面标志

白藜芦醇（resveratrol，Res）是一种非黄酮类多酚化合物，化学名为芪三酚（3，4，5-三羟基二苯乙烯trihydroxystilbene），广泛存在于花生、红葡萄和浆果类等植物果实中，是植物为抵抗外来侵害时产生的一种植物抗毒素（phytoalexin）［1］。1940年首次发现该成分以来，人们开始对Res生物活性及作用机制进行广泛深入的研究。迄今为止的研究表明，Res具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗自由基、心血管保护、免疫调节、植物雌激素等多种生物学功能［2-3］。其中抗肿瘤作用研究最为广泛，近年来，Res的免疫调节作用逐渐受到重视，特别是近年来Res调节细胞信号通路发挥免疫调节作用已成为研究热点。俞瑜等［4］研究表明Res对IL-2的分泌具有抑制作用，并呈剂量依赖性，同时Res也能抑制T细胞表面活化分子。安利峰

等［5］研究表明，Res能增加免疫抑制小鼠NK细胞杀伤力、T淋巴细胞转化、抗体释放量、CH50活性，提高IL-2分泌，减少IL-8分泌。张敏等［6］研究表明，Res作用后，IFN-γ、1L-10及T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表达均明显降低，具有浓度和时间依赖性。邢永华等［7］对137Cs 4Gy辐射损伤小鼠研究表明，Res能提高白细胞、骨髓有核细胞的数量，降低胸腺指数与脾脏指数，说明Res对辐射损伤小鼠的免疫功能的稳定有积极作用。上述对免疫指标的研究都比较单一，本课题组通过对Res对脾淋巴细胞增殖、细胞亚群、细胞周期和分泌细胞因子的影响进行系统研究，探讨Res对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节活性，阐明其免疫学效应，为进一步说明Res的药理作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BALB/C小鼠 雄性，体重18～22 g，购自辽宁医学院实验动物中心，饲养于环境温度（20±2）℃，湿度50%±10%，按照12 h光照/12 h黑暗，自由摄食、饮水的饲养条件喂养，实验前适应性饲养1周；白藜芦醇成都曼斯特生物科技有限公司（生产批号：MUST-12032106）；RPMI-1640培养基粉末 美国GIBCO公司；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白A（ConA）、MTT 美国Sigma公司；胎牛血清 四季青生物工程有限公司；小鼠IL-4和IL-12细胞因子检测试剂盒 武汉博士德公司；Anti-CD4、anti-CD8单克隆抗体 美国eBioscience；Hepes、青霉素、链霉素 上海生物技术服务公司；二甲基亚砜（DMSO）、细胞周期检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。

FACS Calibur流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；Varioskan FlashT多功能酶标仪 Thermo Fisher Scientific；3110 SeriesⅡ细胞培养箱 Thermo Electron Corporation；3K15冷冻离心机 Sigma Corporation；Milli-Q50超纯水净化系统 Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备小鼠脾淋巴细胞 颈椎脱臼法处死小鼠，用75%酒精浸泡消毒3 min。于超净台内分离脾，将脾放于含有PBS的培养皿中，用PBS冲洗2次，将冲洗后的脾放入RPMI-1640培养液中，用5 mL注射器吸取RPMI-1640培养液，将培养液轻轻打入脾内将细胞吹出，重复上述操作数次，直至脾外膜透明，余下脾脏用注射器活塞头磨碎后过100目筛。收集所有的细胞悬液以1500 r/min的速度离心5 min后将上清弃掉，加Tris-NH4Cl约3 mL，轻轻吹匀后静置5 min，去除红细胞，再同样离心去上清，重复上述步骤，直至红细胞完全裂解。细胞沉淀用RPMI-1640培养液重悬，以清除细胞中含有的Tris-NH4Cl，并轻轻吹匀，同样离心弃上清。细胞沉淀用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液悬浮，Trypan Blue染色，细胞计数，活细胞数大于95%，将细胞密度调整为为5×106个/mL，最后制成脾细胞悬液。

1.2.2 MTT法检测脾淋巴细胞增殖 细胞按每孔5×106个加入96孔细胞培养板中，分别设对照组、Res组、Res+ConA组（5 μg/mL ConA）和Res+LPS组（1μg/mL LPS），每孔再分别加入含不同浓度Res的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，使Res终浓度分别5、10、20、40 μg/mL。37℃，5%CO2培养44 h后每孔加入50 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h。之后每孔加入200 μL DMSO，用微量振荡器混匀，检测570 nm的OD值。结果以刺激指数（SI）反映小鼠脾淋巴细胞增殖率的高低：SI=药物刺激孔OD值/阴性对照孔OD值。

1.2.3 ELISA法检测细胞因子 细胞按1×106每孔加入96孔细胞培养板中，每孔再分别加入含不同浓度Res的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，使Res终浓度分别为5、10、20、40 μg/mL，培养48 h后，根据小鼠IL-4和IL-12细胞因子检测试剂盒说明书检测IL-4 和IL-12细胞因子的含量。

1.2.4 流式细胞仪检测脾淋巴细胞膜表面标志 细胞按每孔1×106个加入24孔细胞培养板中，每孔再分别加入含不同浓度Res的含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，使Res终浓度分别5、10、20、40 μg/mL，培养48 h后，弃培养基，用PBS洗两次，与anti-CD4、anti-CD8抗体4℃避光反应60 min，用PBS洗两次后，500 μL PBS重悬，用流式细胞仪检测细胞膜表面标志CD4和CD8表达量的变化。设定488 nm氩激光强度进行测定，利用数据分析软件（ModFit LT）分析检测结果，每个样品计数104个细胞，结果以CD4+CD8-、CD4-CD8+、CD4+CD8+的百分率和CD4+/CD8+比值表示Res对小鼠脾淋巴细胞亚群的影响。

1.2.5 流式细胞仪检测脾淋巴细胞周期 取按上述方法处理过的脾淋巴细胞，根据细胞周期检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测细胞周期，设定488 nm氩激光强度进行测定，利用数据分析软件（ModFit LT）分析检测结果，每个样品计数104个细胞，结果用细胞进入G0/G1期、S期及G2/M期的细胞百分率表示，用S期脾淋巴细胞所占的百分率表示Res对小鼠脾淋巴细胞周期的影响。

1.2.6 统计学分析 各组数据以平均数±标准差表示。应用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。用数据分析软件（ModFit LT）分析流式细胞仪结果。Res各浓度组与对照组比较：*表示差异显著（p＜0.05），**表示差异极显著（p＜0.01）。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇对脾淋巴细胞增殖的影响

2.1.1 白藜芦醇单独刺激对脾淋巴细胞增殖的影响

Res单独刺激脾淋巴细胞，各剂量组均能促进脾淋巴细胞的增殖，结果见图1。Res各剂量组与对照组比较脾淋巴细胞刺激指数均极显著提高（p＜0.01），各剂量组之间比较差异均极显著（p＜0.01）。Res对脾淋巴细胞的增殖能力呈现明显的剂量依赖关系，Res在低剂量时随着剂量的升高，刺激指数随之升高，当剂量达到一定浓度，刺激指数随浓度升高而降低，表明Res对脾淋巴细胞增殖呈现出双重调节作用。

图1 白藜芦醇对脾细胞增殖的影响Fig.1 The influence of resveratrol on splenocyte proliferation

2.1.2 白藜芦醇与脂多糖同时刺激对脾淋巴细胞增殖的影响 Res与LPS同时刺激脾淋巴细胞，各剂量组均能促进脾淋巴细胞的增殖，结果见图1。Res各剂量组与对照组比较脾淋巴细胞刺激指数均极显著提高（p＜0.01），各剂量组之间比较差异均极显著（p＜0.01）。Res与LPS同时刺激对脾淋巴细胞的增殖能力有明显的剂量依赖关系，呈现出双重调节的作用。但Res与LPS同时刺激比Res单独刺激各剂量组刺激指数均降低，表明Res不能协同LPS刺激脾淋巴细胞的增殖。

2.1.3 白藜芦醇与刀豆蛋白A同时刺激对脾淋巴细胞增殖的影响 Res与ConA同时刺激脾淋巴细胞，各剂量组均能促进脾淋巴细胞的增殖，结果见图1。各剂量组与对照组比较刺激指数均极显著提高（p＜0.01）；除了10 μg/mL和20 μg/mL两组之间差异不显著（p＞0.05）外，其他各组之间差异均极显著（p＜0.01）。Res与ConA同时刺激比Res单独刺激各剂量组刺激指数均提高，表明Res能够协同ConA刺激脾淋巴细胞的增殖。

2.2 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响

2.2.1 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-4的影响 Res能刺激脾淋巴细胞分泌IL-4，结果见图2。Res各剂量与对照组比较IL-4分泌均极显著提高（p＜0.01），各剂量组之间比较差异均极显著（p＜0.01）。呈现明显的剂量依赖关系，IL-4的分泌在Res低剂量时，随着Res剂量的升高而升高，当Res剂量达到一定量时，随着Res剂量升高而降低，表明Res对小鼠脾淋巴细胞IL-4分泌呈现双重调节作用。

2.2.2 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌IL-12的影响 Res能刺激脾淋巴细胞分泌IL-12，结果见图2。Res各剂量与对照组比较IL-12分泌均极显著提高（p＜0.01），各剂量组之间比较差异均极显著（p＜0.01）。呈现明显的剂量依赖关系，IL-12的分泌随着Res剂量的升高而升高，呈现正向调节作用。

图2 白藜芦醇对脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响Fig.2 He influence of resveratrol on splenic lymphocyte secretion of cytokines

2.3 白藜芦醇对脾淋巴细胞膜表面标志的影响

Res各剂量组均能提高小鼠脾淋巴细胞中CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+表型的T淋巴细胞亚群百分率，结果见表1和图3。

Res对CD4+CD8-的影响：Res能提高CD4+CD8-百分率，各剂量组与对照组比较均能极显著（p＜0.01）提高CD4+CD8-百分率。随剂量的升高而升高，呈正向调节作用。

Res对CD4+CD8+的影响：Res能提高CD4+CD8+百分率，Res浓度为40 μg/mL剂量组与对照组比较能极显著（p＜0.01）提高CD4+CD8+百分率，Res浓度为5、10、20 μg/mL各剂量组与对照组比较能提高CD4+CD8+百分率，差异不显著（p＞0.05）。随剂量的升高而升高，呈正向调节作用。

Res对CD4-CD8+的影响：Res能提高CD4-CD8+百分率，Res浓度为20 μg/mL剂量组与对照组比较能极显著（p＜0.01）提高CD4-CD8+百分率，Res浓度为10 μg/mL剂量组与对照组比较能显著（p＜0.05）提高CD4-CD8+百分率，Res浓度为5、40 μg/mL剂量组与对照组比较对提高CD4-CD8+百分率差异不显著（p＞0.05）。呈现明显的剂量依赖关系，呈现出双重调节作用。

Res对CD4+/CD8+的比值的影响：CD4+/CD8+的比值可反映机体的免疫状况，结果显示Res各剂量组均能极显著（p＜0.01）提高CD4+/CD8+比值，随剂量的升高而升高，呈正向调节作用。表明Res可以正向调节机体免疫。

2.4 白藜芦醇对脾淋巴细胞周期的影响

Res能促进脾淋巴细胞周期由G0/G1期向S期过度，结果见图4和图5。Res各剂量组与对照组比较均能极显著（p＜0.01）提高脾淋巴细胞进入S期的百分率，表明Res能够促进脾淋巴细胞由G0/G1期向S期转化。细胞周期呈现明显的剂量依赖关系，呈双重调节作用。

表1 白藜芦醇对脾淋巴细胞CD4+/CD8+表达的影响Table1 The influence of resveratrol on CD4+/CD8+expression of splenic lymphocyte

图3 白藜芦醇对脾淋巴细胞CD4+/CD8+表达的影响Fig.3 The influence of resveratrol on CD4+/CD8+expression of splenic lymphocyte

图4 白藜芦醇对脾淋巴细胞进入S期的百分率的影响Fig.4 The influence of resveratrol on the percentage of splenic lymphocyte entering S phase

3 讨论

图5 白藜芦醇对脾淋巴细胞周期的影响Fig.5 The influence of resveratrol on splenic lymphocyte cycle

3.1 淋巴细胞是机体的免疫活性细胞，是获得性免疫系统的重要组成部分。而脾脏是机体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的枢纽。机体免疫功能情况可由淋巴细胞的增殖能力间接反映，如淋巴细胞的活化以及分化为免疫活性细胞，进而增强机体的免疫应答能力［8］。B细胞

主要负责调节机体的体液免疫，T细胞主要负责调节机体的细胞免疫。T细胞还可以进一步分为CD4+T细胞（辅助T淋巴细胞）和CD8+T细胞（毒性T淋巴细胞）。CD4+T和CD8+T细胞之间能够相互影响，两者功能的动态平衡对维持机体免疫状况稳定十分重要。CD4+/CD8+细胞的比值被认为是衡量机体免疫水平的关键指标之一［9］。它们能够释放促炎细胞因子，负责招募不同的效应细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。识别抗原后，激活的Th细胞根据功能和分泌细胞因子的差异分为Th1、Th2细胞［10］。Th1和Th2细胞可以分泌不同类型的细胞因子，这也决定了它们的功能差异［11］。IL-4是由Th1细胞分泌的，主要介导体液免疫反应，对B细胞的活化、增殖、分化等不同阶段起重要作用。IL-12是由树突状细胞、巨噬细胞、B细胞及其他抗原递呈细胞产生，能促进Th1的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生γ干扰素，提高NK细胞的细胞毒作用，促进T细胞的形成，是一种多功能免疫调节因子［12］。细胞周期由G0/G1期向S期过度，使细胞由静止的G0/G1期向DNA合成期即S期转化，并为细胞由S期向活跃的有丝分裂期G2/M期转变提供了必要的条件，从而增强脾淋巴细胞的增殖。本实验结果表明，Res可通过促进脾淋巴细胞增殖、细胞因子分泌、提高脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值、提高脾淋巴细胞周期中细胞进入S期细胞的百分率来增强机体的细胞免疫和体液免疫功能。但对其免疫调节作用机制尚不清楚，还有待进一步深入研究。

3.2 在研究多糖对T细胞增殖能力的影响时，一般使用多糖与ConA共同刺激，因为ConA是小鼠T细胞特异性有丝分裂刺激物，可促进细胞代谢，增加蛋白质合成，加速细胞分裂。体液免疫是指由B细胞被激活后释放特异性抗体从而消除细胞外病原体的免疫反应。LPS能够刺激B细胞的增殖、分化及分泌免疫球蛋白。刺激剂ConA和LPS可使细胞增殖转化，其机制主要是通过与淋巴细胞膜上的受体结合，进而诱导胞内信号传导［13］。本研究表明Res能够协同ConA刺激脾淋巴细胞的增殖，Res不能协同LPS刺激脾淋巴细胞的增殖，与多糖作用效果不同，作用机制有待于进一步研究。

4 结论

Res在一定浓度范围内能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖，增强细胞因子IL-4和IL-12的分泌，提高小鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值，提高脾淋巴细胞周期中细胞进入S期细胞的百分率。结果表明Res具有一定的免疫调节效应，为其作为免疫佐剂和免疫增强剂提供理论依据，为Res的产业化发展提供技术支持。

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The influence of resveratrol on immunoregulatory activity of mouse splenic lymphocyte

LIU Ying-bo，FU Yue，HAO Lu，LI Jing-shuang，YU Yang*
（College of Animal Husbandry&Veterinary Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

In order to analyze the influence of resveratrol（Res）on immunoregulatory activity of mouse splenic lymphocyte.Aseptic isolation of mouse spleen to prepare lymphocytes which were cultured in RPMI 1640 supplemented with10% fetal calf serum.The culture media was added ConcanavalinA（ConA），lipopolysaccharide（LPS）as well as Res with different concentration，including 5，10，20，40 μg/mL.After being cultured for different time，MTT method was adopted to detect the proliferation of lymphocytes.ELISA method was used to detect the level of lymphocytes secrete IL-4 and IL-12.The flow cytometry was used to detect the cell cycle and cytomembrane surface markers of lymphocytes.Res could promote the proliferation of mouse splenic lymphocyte.The mixture of Res and ConA could promote the proliferation of mouse splenic lymphocyte together，but the mixture of Res and LPS could not promote the proliferation of mouse splenic lymphocyte together.Res could increase the secretion of IL-4 and IL-12 and enhance the ratio of CD4+/CD8+of mouse splenic lymphocyte as well as improve the percentage that the cells in cycle of splenic lymphocyte enter of the cells in S phase.Res could enhance the immunoregulatory activity of mouse splenic lymphocyte.

resveratrol；lymphocyte；proliferation；cytokines；cell cycle；cytomembrane surface markers

TS255.1

A

1002-0306（2016）08-0335-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.062

2015－09－15

刘英博（1992-），男，在读硕士研究生，研究方向：兽医药理学与免疫学，食品营养与安全，E-mail：478194158@qq.com。

*通讯作者：于洋（1962-），男，博士，教授，研究方向：兽医药理学与免疫学，E-mail：spyuyang@163.com。

辽宁省科技攻关计划（2014214016）。