物理处理玉米皮渣对酶法提取阿魏酰低聚糖的影响

解春艳，游雪娇，侯晓强，吴智艳，*，曹 戈，段秀霞（.廊坊师范学院生命科学院，河北廊坊065000；2.河北省高校食药用真菌应用技术研发中心，河北廊坊065000；.广东省微生物研究所，广东广州50000）

物理处理玉米皮渣对酶法提取阿魏酰低聚糖的影响

解春艳1，2，游雪娇3，侯晓强1，2，吴智艳1，2，*，曹 戈1，段秀霞1
（1.廊坊师范学院生命科学院，河北廊坊065000；2.河北省高校食药用真菌应用技术研发中心，河北廊坊065000；3.广东省微生物研究所，广东广州510000）

以玉米皮渣为原料，考察物理处理对其水解获得阿魏酰低聚糖产量的影响。通过测定不同方法处理前后玉米皮渣细胞壁组成和其结构变化及阿魏酰低聚糖（Feruloyl oligosaccharides，FOs）产量关系，探讨物理处理影响FOs生成的原因。结果表明：高压蒸煮处理使酶解玉米皮渣生成FOs产量提高了1.5倍，原因是高压蒸煮改变了玉米皮渣细胞壁的组成，其中纤维素和果胶质得以释放，增加了纤维素酶和木聚糖酶与底物的接触几率；微波和膨化处理均使玉米皮结构裂解，FOs产量无显著变化。

玉米皮渣，阿魏酰低聚糖，物理处理，酶解

阿魏酰低聚糖（Feruloyl oligosaccharides，FOs）是阿魏酸（Ferulic acid，FA）与糖的羟基通过酯键连接成的一类重要的功能性低聚糖［1］，具有增强免疫力的功效，对包括癌症在内各种疾病的预防具有很好的功效［1］，具有较强的抗氧化活性［2］，对肠道双歧杆菌增殖作用显著［3］，可改善肠道菌群、预防肠癌。目前，国内外阿魏酰低聚糖的研究仅限于实验室水平，尚未有该低聚糖的工业化生产，故其发展空间巨大。

报道称FOs广泛存在于禾本科植物细胞壁［4］。玉米是禾本科植物的一种，是我国种植面积最大的粮食作物之一。玉米淀粉加工业产生大量玉米皮渣工业副产物，尚未得到有效利用［5］。玉米皮渣中含有膳食纤维（52.6%～86.0%）、蛋白质（5.0%～13.0%）、淀粉（4.0%～20.0%）和酚类化合物（2.0%～5.5%）等［5］。玉米

皮渣总酚类化合物中，阿魏酸及其聚合物占90%以上［6］。FOs是FA的羧基与糖羟基通过酯键连接而成的一类低聚糖，采用化学法、酶法和微生物转化法均可获得，目前，常用酶法制备［7］。然而，在玉米种皮细胞壁结构中，半纤维素与纤维素以及半纤维素与木质素的连接，是制约外源酶酶解禾本科植物组织的主要原因［8-9］。本研究拟通过物理方法对玉米皮渣进行处理，以期改变玉米皮渣紧密连接的细胞壁结构，进而促进外源酶的酶解，提高FOs生成量。研究结果将有助于促进FOs的工业化进程，提高玉米皮渣的附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米皮渣 购自河北省沧州市淀粉加工厂；木聚糖酶、纤维素酶 由宁夏夏盛实业集团有限公司提供，酶活分别为600万ug/min·g和140万ug/min·g；NaOH、浓HCl、无水乙醇、磷酸等 为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈 为国产色谱级，国药集团化学试剂有限公司。

ALPHA 1-2 LD冷冻干燥机 德国Marin Christ公司；Hitachi S-3000N扫描式电子显微镜、Hei-VAP Advantage旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；安捷伦1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；Milli-Q纯水机 美国Merck Millipore公司；MLS-3750全自动立式灭菌锅 日本Sanyo公司；SHZ-82A恒温振荡器 常州朗越仪器制造有限公司；P70D20TP-C6微波炉 广东格兰仕集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同物理方法处理玉米皮渣 以玉米皮渣为原料，分别对其进行高压蒸煮、膨化和微波处理。

1.2.1.1 高压蒸煮处理 取200 g玉米皮渣，添加100 mL蒸馏水，置于500 mL三角瓶中，于高压灭菌锅中，采用121℃下处理20 min，温度降至70℃时，取出，于60℃烘箱中烘干待用。

1.2.1.2 膨化处理 取200 g玉米皮渣，置于小型爆米花机，加热并进行瞬间膨化处理，膨化时压力为10 MPa。

1.2.1.3 微波处理 取200 g玉米皮渣置于家用微波炉中进行微波处理，采用中高火，微波功率为525 W，微波处理时间为5 min。

1.2.2 酶解玉米皮渣制备FOs 按上述方法对玉米皮渣分别进行高压蒸煮、膨化和微波处理，然后烘干、粉碎后过80目筛，同时取已过80目筛的未处理样品，分别置于50 mL三角瓶中，按料液比1∶10比例添加磷酸缓冲溶液（50 mmol/L，pH为5.0），并添加纤维素酶（10 g/L）和木聚糖酶（10 g/L），于60℃酶解1 h，95℃灭酶10 min，4000 r/min离心15 min，分别测定上清液中FOs含量［10］。

1.2.3 玉米皮渣电镜扫描 对不同方式处理过的玉米皮渣进行电子显微镜扫描（scanning electron microscope，SEM），加速电压15.0 kV，放大倍数1500×，通过电镜扫描图观察物理处理前后玉米皮渣原料纵横切面形态的变化。

1.2.4 玉米皮渣细胞壁的提取 分别取5 g经高压蒸煮、膨化和微波处理及未处理的玉米皮渣，经研钵研磨后转入离心管中，加50 mL磷酸缓冲液（0.5 mol/L，pH为7.0），振荡混匀后于4000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用50 mL上述缓冲液洗两遍，再用蒸馏水洗1次后，沉淀用50 mL氯仿甲醇溶液（体积比1∶1）［11］，于室温下浸提30 min，4000 r/min离心10 min，再用氯仿甲醇溶液冲洗2次，沉淀用50 mL苯酚/乙酸/水溶液室温振荡（100 r/min）浸提30 min，4000 r/min离心10 min，再用苯酚/乙酸/水溶液冲洗2次（离心去上清），再加蒸馏水50 mL，按照玉米皮渣0.2%的添加量添加α-淀粉酶，离心后，再用蒸馏水淋洗细胞残留物，重复操作两次后，获得的沉淀物于60℃烘干备用。

1.2.5 FOs的测定

1.2.5.1 FOs含量 阿魏酰低聚糖是阿魏酸与低聚糖以酯键形式连接，经碱解后可释放阿魏酸，现报道的FOs结构中阿魏酸与低聚糖组成比例相同［4］，即阿魏酸摩尔含量与FOs摩尔含量相同，故本实验中测定FOs样品液及其碱解液中阿魏酸含量，换算得出FOs的摩尔含量［12］。

1.2.5.2 FOs碱解处理 分别取不同物理处理下的玉米皮渣酶解液1 mL于10 mL离心管中，添加1 mL浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液，于100℃水解90 min，冷却后用1 mol/L的盐酸溶液中和。

1.2.5.3 阿魏酸的液相色谱测定条件 采用AgilentTCC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），30℃，进行HPLC分离，检测器为紫外检测器（UV）；洗脱液为0.1%磷酸水（V/V）（A）和乙腈（B），两者比例为17∶83，流速为1.0 mL/min，进液量为20 μL，检测波长为320 nm。

1.2.6 其他指标及测定方法

1.2.6.1 细胞壁纤维素含量 细胞壁纤维素水解后采用蒽酮比色法测定［13］。

1.2.6.2 细胞壁果胶含量 细胞壁中果胶先螯合后，再采用蒽酮比色法测定［13］。

1.2.6.3 细胞壁木质素含量 参照李靖等［14］的方法，采用溴乙酰比色法测定。

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 木质素、纤维素及果胶测定的标准曲线

通过标准曲线测定并绘制，获得木质素、果胶和纤维素的回归方程分别为y=0.0644x+0.0171，y=0.008x-0.0152和y=0.0042x-0.0294，各方程的R2分别为0.9907，0.9916和0.9911，可用于样品中木质素、果胶及纤维素含量的分析。

2.2 玉米皮渣阿魏酰低聚糖的测定

如图1所示，阿魏酸标准品在液相色谱分析时的出峰时间为8.425 min，采用液相色谱对玉米皮渣酶解获得的FOs样液进行分析，发现其阿魏酸的出峰时间段有小峰出现，说明在酶解液中有阿魏酸单体存在，其源于玉米皮渣原料或是物理处理后使阿魏酸

单体释放仍需后续研究，当用NaOH处理玉米皮渣酶解获得的FOs样液时，可见其阿魏酸出峰点的峰形明显变大，其原因是碱处理使FOs中的阿魏酸酯键断裂，阿魏酸游离析出，故本研究通过测定FOs样液水解前后阿魏酸的增加量来计算FOs生成量。

图1 酶解获得FOs上清液碱解前后及阿魏酸标品液相图Fig.1 HPLC figures of FOs before and after hydrolysis and HPLC figure of ferulic acid standard

2.3 物理处理对酶解生成FOs生成量的影响

将不同物理处理后的玉米皮渣采用相同量的纤维素酶和木聚糖酶酶解处理，测定酶解产物中FOs的含量，结果如表1所示。

表1 不同物理处理酶解生成FOs量Table1 FOs yield by enzymatic method with maize bran of different physical methods

由表1可知，与原样（未经物理处理）相比，高压蒸煮可显著提高玉米皮渣中FOs的生成量，使其产量提高到原样的1.5倍；微波处理和膨化处理后FOs产量与原样相比差异不显著。报道称物理处理可促进外源酶对植物细胞壁的水解作用，进而可提高FOs产量；而微波处理和膨化处理使玉米皮渣单位体积下受力或温度较大，致使玉米皮渣细胞壁结构发生裂解，这有可能使玉米皮渣中存在的阿魏酰低聚糖结构发生破坏［15］，故造成处理后的玉米皮渣再酶解所获得的FOs产量变化不大。

2.4 物理处理对细胞壁成分的影响

由表2可知，经各处理后，玉米皮渣细胞壁组成发生显著变化。微波处理和高压蒸煮使玉米皮渣细胞壁组成中纤维素和果胶含量明显提高，纤维素含量分别提高为33.48 mg/g和31.62 mg/g，两者间差异不显著，但明显高于未处理的23.99 mg/g，果胶含量由原来的3.54 mg/g分别提高为6.43 mg/g和8.98 mg/g，但木质素含量变化不显著。原因可能是高压蒸煮处理主要利用热效应使玉米皮渣结构壁组成发生改变，在高温高压蒸汽作用下，玉米皮细胞壁中果胶质发生溶解，使其含量增加［16］，此结果与本研究中果胶含量规律变化相似。另有报道称高压处理可使紧密结合的大分子结构变得更加松散、多孔，颗粒力度减小［17］，故在本研究中高压蒸煮处理显著提高了酶解后FOs的生成量。微波处理利用热效应和空穴效应使玉米皮渣组成发生改变，其中热效应可能具有与高压蒸煮相似的作用原理，使得玉米皮细胞壁组成变化相似。膨化处理的作用原理主要是机械效应。机械效应是秸秆在膨化机体内彼此间相互挤压、摩擦、剪切，于膨化口处突然减压高速喷射而出，由于运行速度和方向改变而产生很大的内摩擦力。这种内摩擦力加上高温水蒸汽突然膨大而产生的胀力，使玉米皮撕碎，细胞间木质素分布状态改变，纤维素中糖苷键发生断裂［18］，使其转变为小分子可溶性纤维［19］，溶出的纤维素转变为使得细胞壁中木质素含量相对提高。

表2 不同物理处理时玉米皮渣细胞壁各成分含量Table2 Contents of maize bran cell wall composition treated by different physical methods

2.5 物理处理前后玉米皮渣细胞壁结构变化

对物理处理后的玉米皮渣横纵切面进行扫描电镜观察（图2），结果显示不同物理方法处理后，玉米片细胞壁结构发生明显变化，其中膨化处理使玉米

皮细胞壁结构横向和纵向均出现断裂，这与表2中所测玉米皮渣细胞壁组成变化相符，且玉米皮渣细胞壁结构的变化与胡叶碧［20］论文中玉米皮细胞壁结构变化略有相似，由此说明膨化处理使玉米皮渣细胞壁裂解；高压蒸煮和微波处理后玉米皮细胞壁结构出现明显膨胀，且高压蒸煮膨胀效果显著高于微波处理，原因可能是两者加热方式以及加热强度不同；与原样相比，高压蒸煮和微波处理在表面均有不同程度物质的减少，可能是过胶物质溶出造成样品的缺失，这与表2测定结果相符；此外，微波处理后在玉米皮细胞壁结构中亦有少量断裂形成，这可能是微波处理的空穴效应造成了样品中某些物质结构的破坏，其中可能包含有FOs，因而在微波处理后，样品酶解获得FOs量未见显著提高。

图2 不同物理处理后玉米皮细胞壁结构图Fig.2 SEM of maize bran cell wall treated by different physical methods

3 结论

物理处理可辅助酶解提高FOs的生成量，其中高压蒸煮处理可使FOs量提高至原样的1.5倍，其原因是高压蒸煮改变了细胞壁组成，提高了外源酶与底物的接触几率；微波处理和膨化处理对FOs生成量影响不显著，原因是两处理较剧烈，使细胞壁结构裂解同时可能造成FOs的破坏。

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Influence of physical treatment on the yield of feruloyl oligosaccharides from maize bran by enzymatic hydrolysis

XIE Chun-yan1，2，YOU Xue-jiao3，HOU Xiao-qiang1，2，WU Zhi-yan1，2，*，CAO Ge1，DUAN Xiu-xia1
（1.Langfang Teachers University，Life Science College，Langfang 065000，China；2.Applied Technology Researcher Center of Medicinal and Edible Mushroom of Higher Education School of Hebei Province，Langfang 065000，China；3.Microbiology Institute of Guangdong Province，Guangzhou 510000，China）

The influence of physical treatment on the yield of FOs from maize bran was investigated in this paper.In order to explore the function of physical treatment on FOs yield，the changes of composition and structure of maize bran cell wall was determined and the production of FOs was measured.Results indicated that FOs yield was improved 1.5 folds after high pressure steaming，the reason was that the composition of wheat bran cell wall was changed by high pressure steaming，and cellulose and pectin were released，the contact probability of cellulose and xylanase with wheat bran was increased.Cell wall of maize bran was decomposed by microwave treatment and extrusion process，and FOs yield was no obvious change.

maize bran；feruloyl oligosaccharides；physical treatment；enzymatic hydrolysis

TS251.1

B

1002-0306（2016）08-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.048

2015－09－29

解春艳（1983-），女，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：xcy8046@163.com。

*通讯作者：吴智艳（1957-），女，硕士，教授，研究方向：微生物，E-mail：lfwuzhiyan@126.com。

河北省教育厅优秀青年基金项目（YQ2013027）；河北省高等学校科学技术研究项目（Z2014049）；河北省高校食药用菌应用技术研发中心项目（YF201411-321），河北省高等学校遗传学重点发展学科项目（201221）；廊坊师范学院微生物学重点学科项目（201501）；廊坊师范学院博士基金项目（LSLB201407）。