MALDI-TOF质谱法分析与鉴定骆驼乳中的磷酸肽

黄 漩，王俊平，2，王俊英，刘翠翠，王 硕，*（.教育部食品营养与安全重点实验室，天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学，天津00457；2.东北农业大学食品安全与营养协同创新中心，黑龙江哈尔滨5000；.中国农业科学院生物技术研究所，北京0008）

MALDI-TOF质谱法分析与鉴定骆驼乳中的磷酸肽

黄 漩1，王俊平1，2，王俊英3，刘翠翠1，王 硕1，*
（1.教育部食品营养与安全重点实验室，天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学，天津300457；2.东北农业大学食品安全与营养协同创新中心，黑龙江哈尔滨150030；3.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）

建立一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）为基础的方法检测并鉴定骆驼乳中的磷酸化肽段。通过商品化的二氧化钛（TiO2）材料富集驼乳中低丰度的磷酸肽，并优化出TiO2富集材料与驼乳中磷酸肽相互作用最适宜的吸附洗脱条件，孵育缓冲液：乙腈/水（50∶50，v/v）+1%三氟乙酸，洗脱液为10%氨水。再将得到的磷酸肽溶液用MALDI-TOF MS方法检测，用Mascot数据库进行数据检索，能够从驼乳中鉴定出四个磷酸化肽段。本研究为不同哺乳动物乳中磷酸化肽段的检测提供了一些新的思路且能够应用于掺假乳的鉴别。

MALDI-TOF MS，骆驼乳，富集，磷酸化肽段

一些蛋白多肽具有特殊的生理功能，以非活性状态潜伏在蛋白质体系中，经过适当的酶解，能够转变为具有特殊生理功能的活性状态发挥其作用。目前，研究最多的是矿物质元素结合肽酪蛋白磷酸肽（CPPs）。CPPs能够促进钙吸收，避免钙的沉淀，因此可用作食品钙强化剂［1］。CPPs还是一种良好的金属结合肽，可作为许多矿质元素的载体，结合游离的Fe、Cu、Zn等金属离子形成可溶性盐，促进它们的被动转运过程［2］。还能够应用于牙科疾病的治疗，使牙齿珐琅质重新钙化抑制龋齿［3］。常用于研究磷酸肽富集的样品为牛乳CPPs，其他哺乳动物的CPPs研究较少，Kamau研究过骆驼乳源肽段［4］，针对骆驼乳CPPs的研究还未见报道，不同哺乳动物乳中的CPPs的氨基酸序列各异，但它们都具有相似的结构特征丝氨酸-磷酸基团，这是其发挥生理功能的重要结构，磷酸基团在不同CPPs中的位置不同使其磷酸解离常数也不同，所

以具有不同的生理活性［5］。鉴定出不同乳中的CPPs并研究其主要的生理功能是未来发展研究的一个重要内容。且通过不同乳中CPPs的鉴定建立出一个全面的CPPs质谱图库也能够成为鉴别乳掺假的一个重要指标。

因为磷酸肽的低含量及低离子化效率等特点对磷酸肽的检测造成了极大的困难，所以在检测磷酸肽前需要先进行富集再用于质谱的鉴定分析［6-7］。现在应用比较广泛的富集磷酸肽策略是固相离子亲和色谱法［8-12］和金属氧化物亲和色谱法［13-17］。本文采用的是金属氧化物亲和色谱法，先用商品化的TiO2材料富集驼乳CPPs，再通过MALDI-TOF-MS进行分析，Mascot数据库检索，鉴定出驼乳中四种不同的CPPs。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乙腈（ACN）、氨水 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；三氟乙酸 美国Alfa Aesar公司；碳酸氢铵 天津博迪化工股份有限公司，分析纯；磷酸 博欧特（天津）化工贸易有限公司，分析纯；2，5-二羟基苯甲酸（DHB） 德国Bruker公司；尿素 上海生工生物有限公司；1，4-二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶 美国Sigma公司；骆驼乳 新疆旺源驼奶实业有限公司。

UltrafleXtremeTM基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、MTP384不锈钢靶板 德国Bruker公司；HH-S1恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂；Centrifuge 5804R台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 骆驼乳酶解液的制备 量取0.25 mL骆驼乳（蛋白质含量3.6 mg/100 mg）加入到0.25 mL尿素（8 mol/L，50 mmol/L NH4HCO3）中，涡旋混匀，室温下变性2.5 h。在变性溶液中加入20 μL DTT（10 mmol/L，50 mmol/L NH4HCO3），37℃水浴摇床中振荡2 h。然后加入20 μL IAA（20 mmol/L，50mmol/L NH4HCO3）进行烷基化，用锡纸包住避光，常温振荡30 min。将混合溶液用碳酸氢铵缓冲溶液（50 mmol/L）稀释10倍，以防止高浓度的尿素影响胰蛋白酶的活性，然后加入230 μL胰蛋白酶溶液（1 mg/mL），在37℃水浴摇床中酶解16 h，酶解后得到的产物分装后冷冻保藏，备用［18］。

1.2.2 磷酸化肽段的富集 称取商品化的TiO2材料2.0 mg溶于配制好的吸附缓冲液中润洗一遍，离心分离（5000 r/min）5 min，弃去上清溶液。将润洗后的材料与稀释到一定浓度的磷酸肽酶解液（用孵育缓冲溶液稀释）混合，用移液枪反复吸打，涡旋振荡，使材料与磷酸肽能够充分混合，静置30 min，离心分离（5000 r/min）5 min，保留上清液用于检测是否清洗干净非磷酸化肽，用孵育溶液清洗吸附磷酸肽的材料，直到上清液中检测不到肽段为止，然后用200 μL一定浓度的氨水洗脱材料上吸附的磷酸肽，将氨水与吸附磷酸肽的材料充分混合（吸打、涡旋），静置30 min，离心分离（5000 r/min）5 min，上清溶液用透析袋（截留分子量500～1000）在去离子水中透析1 h，得到的溶液冷藏，用于MALDI-TOF的检测。

分别通过乙腈（30%、50%、70%）与TFA（0.1%、0.5%、1.0%）在孵育缓冲液中的添加量实验商品化TiO2材料富集驼乳中磷酸肽的最适孵育缓冲液条件，用不同含量的氨水水溶液实验商品化TiO2材料富集驼乳中磷酸肽的最适洗脱液条件。

1.2.3 MALDI-TOF MS分析 使用布鲁克公司的UltrafleXtremeTM飞行时间质谱检测分析磷酸化肽段，配备有延迟萃取装置和一个波长为337 nm的脉冲氮气激光，在正离子反射模式下进行，激光频率2000 Hz，加速电压25 kV，单次扫描信号累加1000次，靶板为MTP 384不锈钢靶板，经过材料富集的酶解肽段用0.1%TFA水溶液稀释到一定的浓度，取2 μL稀释的酶解肽段与2 μL DHB基质（20 mg/mL，30%ACN，1%H3PO4）混和，取1 μL混合后的溶液点在靶板上用于MALDI-TOF MS分析。

MASCOT（http：//www.matrixscience.com/）用于数据库搜索鉴定相应的肽段。数据库：SwissProt；分类学：Mammalia（mammals）；质量容忍度：100 ppm；固定修饰：Carbamidomethyl（C）；可能修饰：氧化（M），磷酸化（ST）；反射正离子检测模式。

2 结果与讨论

2.1 孵育缓冲溶液的优化

不同材料的最佳孵育缓冲液和洗脱条件会有一定的差异，TiO2是两性金属氧化物，在适当的条件下，对非磷酸肽也会展现出较强的亲和性，所以优化TiO2材料富集驼乳中磷酸肽的吸附、洗脱条件是必要的。

2.1.1 乙腈含量对富集磷酸肽的影响 肽段具有疏水性的特点，而具有磷酸基团的肽段易溶于水，孵育缓冲液中的乙腈能够消除疏水性非磷酸肽与金属氧化物之间的非特异性吸附作用，能够减少非磷酸肽的干扰。

未经过富集的驼乳胰蛋白消化液如图1-A所示，没有富集到任何磷酸肽，整个质谱图由非磷酸肽占据主导地位；图1-B展示出的是乙腈/水（0.5%TFA）为30/70时得到的质谱图，虽然能检测到四种磷酸化肽段及其中性丢失分子，但是伴随有许多非磷酸肽的干扰，乙腈含量较低不能完全消除非磷酸肽的干扰；当乙腈与水的比例为50/50，在质谱图中能观察到只有磷酸肽及其中性丢失分子（图1-C），基本没有非磷酸肽的干扰；乙腈/水的比例为70/30时（图1-D），虽然非磷酸肽的干扰较少，但是磷酸肽的强度也有所降低，磷酸肽因磷酸基团的存在具有较强的亲水性，在适当的乙腈与水比例中才能使磷酸肽与材料充分作用。所以最后优化出的最适宜的乙腈与水的比例为50/50。

2.1.2 三氟乙酸含量对富集磷酸肽的影响 TiO2是两性金属氧化物，在酸性条件下，能够与磷酸肽结合，在碱性条件下，释放出磷酸肽，而pH在3.5～4.5的酸性氨基酸会干扰材料对磷酸肽的富集，分别添加0.1%、0.5%和1%的TFA研究TiO2富集材料与磷酸肽结合的最适pH。当TFA的添加量为0.1%时，如图2-A所示，有许多非磷酸肽的干扰，TFA含量较低，使pH较高，一些酸性的非磷酸肽与材料发生非特异性的吸附，没有完全洗脱掉非磷酸肽。TFA的含量增加到0.5%时

（图2-B），非磷酸肽的信号虽然得到抑制，还是有一些非磷酸肽的干扰，且磷酸肽的信号要弱于TFA添加量为1.0%的磷酸肽信号。从图2-C可知，当添加量为1.0%时，基本没有非磷酸肽的干扰。因此，把1.0% TFA添加到乙腈和水的混合液（ACN∶H2O=50∶50）中，作为最佳条件的孵育缓冲溶液用于磷酸肽的富集。

图1 骆驼乳酶解液使用不同比例乙腈与水孵育缓冲液的MALDI-TOF MS质谱图Fig.1 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest using different ratios of ACN and water in incubation

2.2 洗脱条件的优化

MALDI-TOF MS分析前，需要通过适当的洗脱液最大限度的把富集到材料上的磷酸肽洗脱下来。在碱性条件下，金属氧化物显示出路易斯碱的性质会释放富集在材料上的磷酸肽，所以磷酸肽的洗脱需要在碱性条件下进行。在这个研究中，5%、10%和15%的氨水被用作考察最佳洗脱条件。当5%NH3·H2O作为洗脱液（图3-A）时，只能检测到两种磷酸肽，且信号较弱伴随着非磷酸肽的干扰，氨水含量较低导致pH较低，不能把吸附在材料上的磷酸肽完全洗脱下来，磷酸肽信号较弱不能抑制住非特异性吸附残留的非磷酸肽的信号；当氨水的含量为10%（图3-B）时，能够检测到全部磷酸肽及其中性丢失片段，基本没有非磷酸肽干扰；当氨水的含量为15%（图3-C）时，虽然能检测到四种磷酸肽，但同时也出现非磷酸肽的干扰，氨水浓度过大，发生了强力洗脱，将材料上吸附的所有肽段都洗脱下来造成了大量的非磷酸肽干扰。所以10%NH3·H2O作为最佳的洗脱液，这时的pH大概在11左右，磷酸基团与金属化合物之间的吸附强度降至最小，能洗脱下大量的磷酸肽。

图2 骆驼乳酶解液使用不同TFA含量孵育缓冲液的MALDI-TOF MS质谱图Fig.2 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest using different contents TFA in incubation

2.3 磷酸肽的鉴定

采用MALDI-TOF MS对分离富集的驼乳酪蛋白磷酸肽进行准确的鉴定分析，单峰骆驼的αS1-酪蛋白共有230个氨基酸，αS2-酪蛋白有193个氨基酸，β-酪蛋白有232个氨基酸，理论序列已经明确。驼乳

酶切后经MALDI-TOF-TOF MS检测，扫描范围为m/z 700～3500的一级质谱图见图4。选择信号强度较高的m/z 1411.68，m/z 2229.27，m/z 2386.19，m/z 2523.11肽段用串联质谱进行序列分析，通过Mascot数据库检索，在m/z 1411.68（图5A），m/z 2229.27（图5B），m/z 2386.19（图5C），m/z 2523.11（图5D）二级质谱图

中能够观察到连续的b和y离子峰，鉴定出四种肽段的序列，详细的序列信息见表1。

图3 骆驼乳酶解液使用不同氨水含量洗脱液的MALDI-TOF MS质谱图Fig.3 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest using different contents of NH3·H2O in eluent

图4 骆驼乳酶解液MALDI-TOF MS质谱图Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of tryptic camel milk

图5 驼乳酶解液MALDI-TOF-TOF MS质谱图Fig.5 MALDI-TOF-TOF MS spectra of tryptic camel milk digest

表1 通过MALDI-TOF-TOF MS分析的骆驼酶解液中的磷酸肽Table1 The phosphopeptides from tryptic camel milk digest were identified by MALDI-TOF-TOF MS analysis

3 结论

本工作是以骆驼乳为研究对象，通过TiO2材料对其中的磷酸肽进行富集，分别从孵育缓冲液中的乙腈含量、TFA含量及洗脱液中氨水含量三个方面对材料的富集条件进行优化，通过MALDI-TOF MS结果分析出最适合的孵育缓冲液为乙腈/水（50/50，1% TFA），洗脱液为10%NH3·H2O，在优化条件下，对样品进行二级质谱分析，经Mascot数据库检索，鉴定出四个磷酸化肽段。该方法简单快速，能够应用于不同乳制品中磷酸肽的检测，同时对骆驼乳蛋白质组学分析具有重要的参考意义，同时也为加工骆驼乳相关的功能性食品奠定了理论基础。

［1］董开发，谢明勇.乳源性生物活性肽［J］.中国食品学报，2004，4（4）：86-91.

［2］Meisel H.Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins［J］.Biopolymers，1997，43（2）：119-128.

［3］Clare DA，Swaisgood HE.Bioactive milk pepetides：a prospectus ［J］.J Dairy Sci，2000，83：1187-1195.

［4］Kamau SM，Lu RR，Chen W，et al.Functional significance of bioactive peptides derived from milk proteins［J］.Food Reviews International，2010，26：386-401.

［5］Meisel H.Overview on milk protein-drived peptides［J］.Int Dairy Journal，1998，8：363-373.

［6］Dunn JD，Reid GE，Bruening ML.Techniques for phosphopeptide enrichment prior to analysis by mass spectrometry［J］.Mass Spectrometry Reviews，2010，29（1）：29-54.

［7］Witze ES，Old WM，Resing KA，et al.Mapping protein post-translational modifications with mass spectrometry［J］.Nature Methods，2007，4（10）：798-806.

［8］Yan YH，Zheng ZF，Deng CH，et al.Facile synthesis of Ti4+-immobilized Fe3O4@polydopamine core-shell microspheres for highly selective enrichment of phosphopeptides［J］.Chemical Communications，2013，49（44）：5055-5057.

［9］Feng S，Ye ML，Zhou HJ，et al.Immobilized Zirconium Ion Affinity Chromatography for Specific Enrichment of Phosphopeptides in Phosphoproteome Analysis［J］.Molecular&Cellular Proteomics Mcp，2007，6（9）：1656-1665.

［10］Aryal UK，Olson DJH，Ross ARS.Optimization of immobilized gallium（III）ion affinity chromatography for selective binding and recovery of phosphopeptides from protein digests［J］.Journal of Biomolecular Techniques，2009，19（5）：296-310.

［11］Kinoshita E，Yamada A，Takeda H，et al.Novel immobilized zinc（II） affinity chromatography for phosphopeptides and phosphorylated proteins［J］.Journal of Separation Science，2005，28（2）：155-162.

［12］Allan S，Søren A，Nørregaard JO.Characterization of phosphoproteins from electrophoretic gels by nanoscale Fe（III）affinity chromatography with off-line mass spectrometry analysis ［J］.Proteomics，2001，1（2）：207-222.

［13］Lu ZD，Duan JC，He L，et al.Mesoporous TiO2nanocrystal clusters for selective enrichment of phosphopeptides［J］.Analytical Chemistry，2010，82（17）：7249-7258.

［14］Kweon HK，Håkansson K.Selective Zirconium Dioxide-Based Enrichment of Phosphorylated Peptides for Mass Spectrometric Analysis［J］.Analytical Chemistry，2006，78（6）：1743-1749.

［15］Li Y，Lin HQ，Deng CH，et al.Highly selective and rapid enrichment of phosphorylated peptides using gallium oxidecoated magnetic microspheres for MALDI-TOF-MS and nano-LC-ESI-MS/MS/MS analysis［J］.Proteomics，2008，8（2）：238-249.

［16］Ficarro SB，Parikh JR，Blank NC，et al.Niobium（V）oxide （Nb2O5）：application to phosphoproteomics［J］.Analytical Chemistry，2008，80（12）：4606-4613.

［17］Chen WY，Chen YC.Functional FeO@ZnO magnetic nanoparticle-assisted enrichment and enzymatic digestion of phosphoproteins from saliva［J］.Analytical& Bioanalytical Chemistry，2010，398（5）：2049-2057.

［18］Li WW，Deng QL，Fang GZ，et al.Facile synthesis of Fe3O4@TiO2ZrO2and its application in phosphopeptide enrichment ［J］.Journal of Materials Chemistry B，2013，1（14）：1947-1961.

Analysis and identification of the phosphopeptides in camel milk by MALDI-TOF MS

HUANG Xuan1，WANG Jun-ping1，2，WANG Jun-ying3，LIU Cui-cui1，WANG Shuo1，*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；3.Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

The MALDI-TOF MS-based method was establised for determining and identifing phosphopeptides in camel milk.The low abundance phosphopeptides of camel milk was enriched using commercial TiO2，and optimized the suitable adsorption-elution condition between the commercial TiO2and camel milk，incubation buffer：acetonitrile/water（50/50，v/v）+1% trifluoroacetic acid，eluent：aqueous ammonia（10%）.The obtained phosphopeptides solution was determined by MALDI-TOF MS method，and the data searching was carried out using Mascot database，four phosphopeptides was identified in the camel milk.This study provided a new idea for the phosphopeptides of different mammal milk determination and applied to the adulterated milk identification in the practical application.

MALDI-TOF MS；camel milk；enrichment；phosphopeptides

TS207.3

A

1002-0306（2016）08-0072-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.006

2015－09－10

黄漩（1986-），女，博士研究生，研究方向：食品安全检测，E-mail：huangyukun609@163.com。

*通讯作者：王硕（1969-），男，教授，研究方向：食品安全，E-mail：s.wang@tust.edu.cn。

国家“863”高新技术项目（2012AA101604）；转基因重大专项（2014ZX08012-001）。