牛血清白蛋白-5-磺基水杨酸体系的荧光共振能量转移研究

张　娟，刘建平，朱彦姝

(宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004)



牛血清白蛋白-5-磺基水杨酸体系的荧光共振能量转移研究

张娟，刘建平，朱彦姝

(宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004)

采用荧光发射光谱和紫外吸收光谱研究了牛血清白蛋白(BSA)-5-磺基水杨酸(SSA)体系的荧光共振能量转移。结果表明，SSA可以猝灭BSA的荧光且使BSA荧光发射峰蓝移，但峰形未改变；随SSA浓度的增大，BSA紫外吸收光谱的最大吸收峰红移且强度逐渐增强；根据Förster非辐射能量转移原理计算得到BSA-SSA体系中供体(BSA)与受体分子(SSA)间距离为2.42 nm。

牛血清白蛋白(BSA)；5-磺基水杨酸(SSA)；荧光猝灭；能量转移

5-磺基水杨酸(SSA)是水杨酸(salicylicacid,SA)衍生物，属于芳香族含氧酸，具有内源性荧光[1]。与SA及其它衍生物相比，SSA具有较好的水溶性，因而在水体研究[2]、工业[3]、医药[4]等众多领域应用广泛。血清白蛋白是有机体循环系统中大量存在的一种可溶性蛋白，其重要生理功能之一是与体内外不同配体(血浆中的脂肪酸、药物、生物活性小分子和金属离子等[5-6])发生可逆性键合，这种键合将影响配体在体内的吸收、分配、代谢、排泄等[7-8]。因此，有关蛋白与配体相互作用的研究十分重要，受到广泛关注[9-10]，但有关牛血清白蛋白(BSA)与SSA相互作用的研究却少见报道。鉴于此，作者研究了BSA-SSA体系的荧光发射光谱和紫外吸收光谱，并利用Förster非辐射能量转移原理计算了BSA与SSA之间距离，拟为相关研究提供参考。

1　实验

1.1试剂与仪器

SSA，美国Fluka公司，以二次蒸馏水配制成原溶液，使用时适当稀释；BSA(全组分)，美国Sigma公司，直接溶解于二次蒸馏水中配成原溶液；三羟甲基氨基甲烷(Tris，含量≥99%)，上海化学试剂公司分装厂，配制成pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液；NaCl(分析纯)，上海化学试剂公司，以二次蒸馏水配制成浓度为0.5mol·L-1的NaCl溶液。所有原溶液均于0～4 ℃暗处储存。

F-4600型荧光光谱仪(配置150W氙灯和恒温水浴槽)、U-3310型紫外可见分光光度计，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1BSA-SSA体系的配制

取一定量的BSA和SSA溶液、2.0mLTris-HCl缓冲溶液、2.0mLNaCl溶液置于10mL比色管中，用二次蒸馏水稀释至10mL，搅拌均匀，即得BSA-SSA体系。

1.2.2BSA-SSA体系的光谱测定

荧光发射光谱于恒温294 K测定，激发波长280 nm，激发和发射狭缝宽度均为2.5 nm，扫描速度 1 200 nm·min-1；紫外吸收光谱于室温测定，狭缝宽度2 nm。

2　结果与讨论

2.1BSA-SSA体系的荧光发射光谱

荧光猝灭是指荧光量子产率降低(即荧光强度减弱)。不同的分子间相互作用均可导致荧光猝灭，包括分子重排、能量转移、基态复合物形成、碰撞猝灭等[11]。

固定BSA浓度、改变SSA浓度，研究SSA对BSA荧光发射光谱的影响，结果见图1。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-6 mol·L-1)：0、0.41、0.83、1.24、1.65

由图1可知，当λex=280 nm时，BSA在338 nm处有强荧光峰，主要由色氨酸残基引起；随SSA浓度的增大，BSA位于338 nm处的荧光峰强度逐渐减弱，401 nm处的荧光峰强度逐渐增强。表明SSA对BSA的荧光具有猝灭作用。另外，随SSA浓度的增大，BSA荧光发射峰发生蓝移，表明荧光猝灭可能是由BSA与SSA形成复合物引起的[12]。

2.2BSA-SSA体系的紫外吸收光谱

固定BSA浓度、改变SSA浓度，研究SSA对BSA紫外吸收光谱的影响，结果见图2。

cBSA=9.07×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-5 mol·L-1)：0、2.06、4.12、6.18、8.24

由图2可知，随SSA浓度的增大，BSA位于278.5 nm处的最大吸收峰发生红移，且吸收峰强度逐渐增强。表明BSA与SSA形成了复合物[13]。

2.3BSA-SSA体系的荧光共振能量转移

荧光共振能量转移(FRET)可分为辐射能量转移和非辐射能量转移，供体分子荧光发射光谱发生畸变时发生辐射能量转移。由2.1可知，SSA可有效猝灭BSA的荧光，说明BSA-SSA体系存在能量转移。当加入SSA时，BSA荧光发射光谱并未发生畸变，可认为BSA-SSA体系的荧光共振能量转移属于非辐射能量转移。根据Förster非辐射能量转移原理[14]，发生能量转移必须满足以下条件：(1)供体可发射荧光；(2)供体分子的荧光发射光谱与受体分子的紫外吸收光谱有足够的重叠；(3)供体与受体足够接近，最大距离不超过7 nm。

非辐射能量转移效率(E)、供体和受体之间距离(r)与临界能量转移(E=50%)距离(R0)的关系[14]如下：

(1)

(2)

(3)

式中：F、F0分别为有无猝灭剂时供体的荧光强度；K2为偶极空间取向因子，取供体和受体各向随机分布的平均值2/3；n为介质折射系数，一般取水和有机物折射指数的平均值1.336；φ为供体荧光量子产率，对于BSA为0.13[15]；J为供体荧光发射光谱与受体紫外吸收光谱的重叠积分(图3)；F(λ)为供体在波长为λ处的荧光强度；ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔吸光系数。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　cSSA=5.16×10-5 mol·L-1

根据式(1)～(3)，可计算得到以下参数：J=7.67×10-16cm3·L·mol-1，R0=1.52 nm，E=0.0573，r=2.42 nm。BSA的内源性荧光主要由色氨酸残基引起。BSA分子含有2个色氨酸残基，Trp-212残基位于子域ⅡA，而Trp-134残基位于子域ⅠB。Trp-134残基不易与水溶性配体接近，因此SSA仅与Trp-212残基相互作用，其相互作用距离为2.42 nm。供体和受体之间距离r<7 nm且0.5R0

3　结论

采用荧光发射光谱和紫外吸收光谱研究了牛血清白蛋白(BSA)-5-磺基水杨酸(SSA)体系的荧光共振能量转移。结果表明，SSA可以猝灭BSA的荧光且使BSA荧光发射峰蓝移，但峰形未改变；随SSA浓度的增大，BSA紫外吸收光谱的最大吸收峰红移且强度逐渐增强；根据Förster非辐射能量转移原理计算得到BSA-SSA体系中供体与受体分子间距离为2.42 nm。

[1]POZDNYAKOV I P,PLYUSNIN V F,GRIVIN V P.Photolysis of sulfosalicylic acid in aqueous solutions over a wide pH range[J].Journal of Photochemistry and Photobiology A：Chemistry,2006,181(1):37-43.

[2]LUDEMANN H C,HILLENKAMP F,REDMOND R W.Photoinduced hydrogen atom transfer in salicylic acid derivatives used as matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) matrixes[J].Journal of Physical Chemistry A,2000,104(17):3884-3893.

[3]YANG Y,GAO Q M.Influence of sulfosalicylic acid in the electrolyte on the optical properties of porous anodic alumina membranes[J].Physics Letters A,2004,333(3/4):328-333.

[4]MORIYAMA T,KEMI M,OKUMURA C,et al.Involvement of advanced glycation end-products, pentosidine andNε-(carboxymethyl)lysine, in doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats[J].Toxicology,2010,268(1):89-97.

[5]LI D J,ZHU M,XU C,et al.Characterization of the baicalein-bovine serum albumin complex without or with Cu2+or Fe3+by spectroscopic approaches[J].European Journal of Medicinal Ch-emistry,2011,46(2):588-599.

[6]CUI F L,WANG J L,YAO X J,et al.Spectroscopic and molecular modeling studies of the interaction between cytidine and human serum albumin and its analytical application[J].Biopolymers,2007,87(2/3):174-182.

[7]WU Q,LI C H,HU Y J,et al. Study of caffeine binding to human serum albumin using optical spectroscopic methods[J].Science in China Series B:Chemistry,2009,52(12):2205-2212.

[8]CARTER D C,HO J X.Structure of serum albumin[J].Advances in Protein Chemistry,1994,45:153-203.

[9]SULKOWSKA A,BOJKO B,RWNICKA J,et al.The competition of drugs to serum albumin in combination chemotherapy:NMR study[J].Journal of Molecular Structure,2005,744/745/746/747:781-787.

[10]SINGH T S,MITRA S.Interaction of cinnamic acid derivatives with serum albumins:a fluorescence spectroscopic study[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2011,78(3):942-948.

[11]ZHANG H X,HUANG X,MEI P,et al.Studies on the interaction of tricyclazole withβ-cyclodextrin and human serum albumin by spectroscopy[J]. Journal of Fluorescence,2006,16(3):287-294.

[12]WANG T H,ZHAO Z M,ZHANG L,et al. Spectroscopic studies on the interaction between troxerutin and bovine serum albumin[J]. Journal of Molecular Structure,2009,937(1):65-69.

[13]CUI F L,FAN J,LI J P,et al.Interactions between 1-benzoyl-4-p-chlorophenyl thiosemicarbazide and serum albumin:investigation by fluorescence spectroscopy[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2004,12(1):151-157.

[14]LAKOWICZ J R.Principles of Fluorescence Spectroscopy[M].3rd,Singapore:Springer Press,2006:278-290.

[15]ZHANG G W,QUE Q M,PAN J H,et al.Study of the interaction between icariin and human serum albumin by fluorescence spectroscopy[J].Journal of Molecular Structure,2007,881(1/2/3):132-138.

[16]VALEUR B.Molecular Fluorescence:Principles and Applications[M].New York:Wiley Press,2001:250.

Fluorescence Resonance Energy Transfer of Bovine Serum Albumin-5-Sulfosalicyclic Acid System

ZHANG Juan,LIU Jian-ping,ZHU Yan-shu

(SchoolofBasicMedicalSciences,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Fluorescenceresonanceenergytransferofbovineserumalbumin(BSA)-5-sulfosalicyclicacid(SSA)systemwasstudiedbyfluorescenceemissionandUVabsorptionspectra.Resultsshowedthat,thefluorescenceemissionspectrumofBSAwasquenchedbyadditionofSSAsolutionandthefluorescenceemissionpeakofBSAemergedablueshift,butthepeakshapeofBSAfluorescencespectrumwasunchanged.ThemaximumUVabsorptionpeakofBSAemergedaredshiftanditsabsorbanceintensityincreasedobviouslywiththeincreasingofSSAconcentration.AccordingtoFörstertheoryofnon-radiationenergytransfer,thedistancebetweenthedonor(BSA)andtheacceptor(SSA)inBSA-SSAsystemwascalculatedas2.42nm.

bovineserumalbumin(BSA);5-sulfosalicyclicacid(SSA);fluorescencequenching;energytransfer

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.010

宁夏卫生计生委(宁夏卫生厅)科研项目(2012051)

2016-03-24

张娟(1976-)，女，宁夏银川人，副教授，研究方向：电化学及光化学，E-mail:zhangjuano13@126.com。

O 657.39

A

1672-5425(2016)08-0042-03

张娟，刘建平，朱彦姝.牛血清白蛋白-5-磺基水杨酸体系的荧光共振能量转移研究[J].化学与生物工程，2016，33(8)：42-44.