云南省马铃薯黑痣病病原菌融合群鉴定及8种药剂对其的毒力

刘　霞,　冯　蕊,　高达芳,　王东岳,　杨艳丽

(云南农业大学植物保护学院, 云南省植物病理重点实验室, 昆明　650201)



云南省马铃薯黑痣病病原菌融合群鉴定及8种药剂对其的毒力

刘霞,冯蕊,高达芳,王东岳,杨艳丽*

(云南农业大学植物保护学院, 云南省植物病理重点实验室, 昆明650201)

由立枯丝核菌引起的马铃薯黑痣病是一种常见的土壤和种薯传播病害,在世界各地均有发生。本试验对分离纯化的67个丝核菌菌株进行融合群测定,结果表明:67个菌株都属于AG3融合群;对其中来自6个不同地域的11个菌株进行ITS测定, 11个菌株的相似度为99%。8种药剂对马铃薯黑痣病菌的毒力测定结果表明,20%氟胺·嘧菌酯水分散粒剂50 mg/L和25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂50 mg/L的抑菌效果较好,室内抑菌效果可达100%。

马铃薯黑痣病;融合群;毒力测定

马铃薯黑痣病是世界范围内的病害,世界各地均有不同程度的发生。20世纪70年代以来,日本、欧美的发达国家就已经十分重视对此病的研究,并有过不少相关报道[1-2]。在国内,彭文学等[3]研究发现河北省有马铃薯黑痣病,而且是几种常见的真菌病害之一。

马铃薯黑痣病又称立枯丝核菌病、茎基腐病、丝核菌溃疡病、黑色粗皮病,是由立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)引起的一种土传真菌病害。关于丝核菌(尤其是立枯丝核菌)的分类,Parmeter等[4]在1969年系统地提出了Rhizoctoniasolani种内的融合群(anastomosis group)分类法,将欧洲、北美、澳大利亚等地的138个分离菌株归为4个融合群,记为AG1～AG4。随后, Ogoshi[5]、李华荣[6]对立枯丝核菌进行了系统的描述,在此基础上,根据融合群频率、硫胺素需求、同工酶谱、致病性、DNA碱基同源性和培养性状等特性将其划分为不同亚群。到目前为止,立枯丝核菌已被划分为14个融合群,分别命名为AG1～AG13和AG-BI[6-7]。从分布上看,AG1～AG4在全世界均有分布,AG7和AG-BI主要分布于亚洲的日本,AG6主要分布于日本和以色列,AG8分布于中国和澳大利亚。虽然立枯丝核菌的融合群遍布于全世界,但是局部地区的融合群种类却很单一。某一地区的丝核菌病害,基本是由同一融合群所引起,虽然从同一个病株上可以分离出很多种类的融合群[8],但其致病融合群均为同一种。AG3融合群寄主范围较小,马铃薯为其最适宜寄主[9]。Carling等[7]从马铃薯病株上分离到AG3、AG2-1和双核丝核菌,对其分析表明，AG3为主要致病融合群。除AG3外,AG1、AG2、AG4、AG5、AG7和AG9等也在马铃薯黑痣病的报道中出现过[10-14]。王东岳等[15]报道,云南省马铃薯主产区昆明、曲靖、昭通、丽江、迪庆、大理、宣威等地均有黑痣病的发生,其中昆明地区马铃薯黑痣病发病最严重,发病率达到36%,发病最轻的宣威市发病率亦达到12%。由此可见,马铃薯黑痣病在云南省普遍发生,危害日益加重,对云南省马铃薯黑痣病病菌的融合群进行鉴定，并筛选出有效的杀菌剂十分必要。

1　材料与方法

1.1供试菌株

马铃薯黑痣病菌菌株采自云南省昆明市、丽江市、大理白族自治州、迪庆藏族自治州、昭通市等10个市(州)的41个采集点,共95个样品,经分离纯化共得到67株菌株,包括8株从地上茎(白霉)纯化的菌株和59株从地下薯块(黑痣)纯化的菌株;立枯丝核菌标准菌株(代号为B)属于AG3融合群,由云南农业大学杨根华教授馈赠。

1.2主要试剂

引物:ITS引物由上海生工生物工程有限公司合成;DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司;马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g,琼脂粉17 g,葡萄糖20 g,蒸馏水1 000 mL,高压灭菌(102.9 kPa, 30 min);2%水琼脂培养基(WA):20 g琼脂,1 000 mL水,高压灭菌。

1.3供试药剂

70%甲基硫菌灵可湿性粉剂,日本曹达株式会社;70%噁霉灵可湿性粉剂,青岛海纳生物科技有限公司;25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂,瑞士先正达作物保护有限公司;20%氟胺·嘧菌酯(10%氟酰胺，10%嘧菌酯)水分散粒剂,美国世科姆公司;500 g/L异菌脲悬浮剂,拜耳作物科学(中国)有限公司;60%霜脲·嘧菌脂水分散粒剂,美国世科姆公司;20%辣根素水乳剂(20%异硫氰酸烯丙酯,ATTC),中国农业大学种苗健康北京市工程研究中心提供;10亿/mL芽胞杆菌水剂,南京新果园生态农业科技有限公司。

1.4菌丝融合群测定

1.4.1对峙培养法进行融合群测定

马铃薯黑痣病菌融合群的测定参照陈延熙等的载玻片配对法[16]并加以改进(将载玻片改为效果更加明显的玻璃纸)。菌丝融合类型采用Sneh的融合群标准[17],分为①完全融合:接触的细胞细胞壁溶解,原生质体融合,相互之间具有吸引现象;②完全不融合:细胞壁不溶解,两菌互不干扰,交叉而过;③不完全融合:接触的细胞细胞壁溶解,其中一个细胞的细胞质流入另一个细胞内,引起双方融合,同时可引起接触细胞周围的细胞死亡或者畸形生长,有杀死反应,一方引诱另一方。如果菌丝间能完全融合或不完全融合则被视为同一融合群,根据标准菌株与被测菌株的融合反应鉴定供试菌株的融合群类型。每菌株重复3次。

1.4.2ITS序列分析验证融合群类型

选取11株来自不同地域,与标准菌株属于同一融合群的菌株进行ITS序列测定,进一步检验菌株的融合群类型。

1.4.2.1供试菌株DNA的提取

所有供试菌株先在PDA平板上25 ℃培养3 d,取直径为5 mm的菌盘块转移到铺有无菌玻璃纸的PDA平板中央,25 ℃培养4 d,收集玻璃纸上层菌丝，采用改进的CTAB方法[18]提取马铃薯黑痣病病菌的基因组DNA。

1.4.2.2供试菌株的ITS序列扩增及测定

采用真菌通用引物ITS1/ITS4对马铃薯黑痣病病菌不同融合群ITS区域进行PCR扩增,并将扩增产物送华大基因公司进行纯化测序,根据测序结果分析马铃薯黑痣病病菌不同融合群菌株间系统演化关系。

1.4.2.3序列分析

将测得的11个菌株的ITS序列在NCBI中进行BLAST,同时分别下载7条同源序列,与测定的序列组成原始数据组。运用MEGA 5.05,采用邻接法构建系统发育树,进行融合群的分析及确定。

1.4.38种药剂对马铃薯黑痣病病菌的毒力测定

采用生长速率法[19]测定供试的8种药剂对马铃薯黑痣病病菌的毒力。每种药剂设3个浓度,每个浓度重复3次,同时以不加药剂的PDA培养基作对照。25℃培养3 d后用十字交叉法测量菌落直径,以平均菌落直径代表菌落大小,计算菌落生长抑制率。

抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100。

选取抑制效果较好的3种药剂对来自不同地域的16个菌株进行毒力测定,确定不同地域之间存在的差异,方法同上。

2　结果与分析

2.1马铃薯黑痣病病菌融合群测定

2.1.1对峙培养结果

供试菌株分别与标准菌株进行对峙培养的结果表明,67个菌株均能与标准菌株部分或全部融合,属于AG3融合群。

马铃薯黑痣病病菌菌丝完全融合分为两种情况,一是两个菌丝之间产生连接点,将两个菌丝连接到一起,可以看做是点融合(图1a);另一种是两个菌丝全部紧贴融合在一起,可以看做是面融合(图1b)。可以看出,无论是哪一种融合现象,两种菌丝之间具有亲和性,可以融合到一起,均属于AG3融合群。

图1　马铃薯黑痣病病菌的菌丝融合Fig.1　Hyphal fusion reaction of Rhizoctonia solani isolates from potato

2.1.2ITS序列分析结果

从对峙试验得到的AG3融合群菌株中挑选出6个不同地域的共11个菌株以及标准菌株(代号为B)进行ITS测序,其中2-2号、3号和7号来自丽江市;12号、23号和64号来自昆明市;28号来自保山市;32号来自西双版纳傣族自治州;34号和X1号来自临沧市;48号来自迪庆藏族自治州。ITS测序结果显示,选取的11个菌株ITS序列与GenBank上已知丝核菌AG3的序列相似度达到99%以上,其中64号、23号、12号、X1号、48号菌株和供试的标准菌株与GenBank上编号为AB905378.1的AG3菌株的相似度达到了99%;28号、32号、34号、2-2号菌株与GenBank上编号为AB905383.1的AG3菌株的相似度为99%;3号菌株和7号菌株与GenBank上编号为AB905384.1的AG3菌株的相似度达到了100%,结合平板对峙培养结果分析,可以确定所有菌株均属于融合群AG3。

将这11个菌株、标准菌株和在GenBank上挑选出的7个已知菌株[包括5条AG3菌株的序列:AB905378.1、AB905383.1、AB905386.1、AB905389.1和AB905384.1以及一条AG1(JQ692294.1)和一条AG4(JF699278.1)的序列]共计19条序列进行比对、调整、删减后以邻接法构建系统发育树。由图2可知,平板对峙培养鉴定出的11个菌株、标准菌株以及GenBank上挑选出的5个已知AG3菌株分属于相同的分支,可以确定这些菌株均为AG3,从而验证了对峙培养测定的准确性。因此云南省马铃薯黑痣病病菌最主要的融合群为AG3,对峙培养法是测定融合群类型最简单,有效的方法。

图2　基于ITS序列的云南省马铃薯黑痣病病菌 融合群代表菌株的系统发育树Fig.2　Phylogenic tree based on the ITS sequences of representative strains from different regions

2.28种药剂对马铃薯黑痣病病菌的毒力测定

每种药剂根据建议浓度范围设定3个浓度,每个浓度重复3次,结果表明20%氟胺·嘧菌酯水分散粒剂50 mg/L、25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂50 mg/L、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂150 mg/L、20%辣根素水乳剂(ATTC)200 mg/L、500 g/L异菌脲悬浮剂100 mg/L对马铃薯黑痣病病菌具有抑制作用,其中20%氟胺·嘧菌酯水分散粒剂50 mg/L和25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂50 mg/L抑制率达到100%,70%甲基硫菌灵可湿性粉剂150 mg/L抑制率37.8%,20%辣根素水乳剂(ATTC)200 mg/L和500 g/L异菌脲悬浮剂100 mg/L的抑制率分别为14.4% 和6.7%,其他供试药剂和浓度的抑菌效果不明显(表1)。因此,选择20%氟胺·嘧菌酯水分散粒剂50 mg/L、25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂50 mg/L和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂150 mg/L对来自昆明、临沧、保山、丽江等地的16个菌株进行毒力测定。

测定结果显示,3种药剂对16个丝核菌菌株具有很好的抑制效果,除了25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂50 mg/L对25号的抑制率为31.0%,其他的抑制率均为100%(表2),因此,该3种农药可以在上述地区使用。

表1　8种药剂对马铃薯黑痣病病菌的毒力Table 1　Toxicity of eight fungicides on black scurf of potato

表2　3种药剂对丝核菌不同菌株的抑制效果Table 2　Inhibition effect of three fungicides to different strains of Rhizoctonia solani

3　讨论与结论

3.1融合群比对

通过对67株马铃薯黑痣病病菌融合群的鉴定得出,云南省马铃薯黑痣病病菌的融合群为单一的AG3融合群，这与其他地区的鉴定结果不尽相同。Carling等[20]、Lehtonen等[13]和Yanar等[21]研究马铃薯黑痣病病菌融合群时发现,虽有AG2-1、AG5或AG6等融合群出现,但AG3仍为其主要融合群。有研究人员调查发现马铃薯和魔芋为AG3融合群菌株的最适寄主, AG2融合群的菌株则易感染十字花科作物,这可能是AG3为马铃薯黑痣病病菌的主要致病融合群的原因之一[8]。据报道,采自不同国家的马铃薯黑痣病病菌融合群种类也存在差异,其中,土耳其为AG1～AG3、AG5、AG8～AG10和AG13[22],美国阿拉斯加为AG1～AG8和AG BI[20],法国为AG2-1、AG3和AG5[1]。Chand等[11]研究发现AG2菌株仅从植株上分离得到,这说明马铃薯黑痣病病菌融合群分布与病原菌分离部位有关。本试验的丝核菌菌株来源于两部分，其中从地下薯块共分离59个菌株，经鉴定均为AG3融合群；从地上茎共分离到8个菌株，也均为AG3融合群，表明目前在云南省马铃薯主要产区获得的丝核菌均为AG3融合群，但由于调查区域和采集样品的局限性，不能排除在云南省马铃薯产区存在其他融合群类型，因此需要进一步扩大调查范围，最终明确云南省马铃薯黑痣病病菌融合群的类型和分布。

3.2毒力测定

马铃薯黑痣病作为世界性病害，受到地域、品种等诸多因子的影响，且具有土传和种传的特点，防治较为艰难，生产上还没有抗马铃薯黑痣病的品种[21]。目前主要采用田间管理[21]、轮作倒茬[23]、化学防治[24]以及生物防治[25-27]，其中最有效的依然是化学防治，化学防治常用的药剂有戊菌隆、嘧菌酯、异菌脲、甲基立枯磷、甲基硫菌灵和代森锰锌等[1,12,28]。栽种时可用多菌灵等内吸性杀菌剂浸种或咯菌腈、甲基硫菌灵等药剂拌种[29]或用次氯酸钠和甲基硫菌灵处理种薯[30]来防治。对块茎防效较好的药剂有甲基立枯磷和戊菌隆[31]。本研究测定了8种药剂对马铃薯黑痣病病菌的毒力，结果显示20%氟胺·嘧菌酯水分散粒剂50 mg/L、25 g/L咯菌腈悬浮种衣剂50 mg/L和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂150 mg/L对云南各地区的黑痣病病原菌有较好的防效，可在大田进一步试验验证。Kataria等[28,32]对10组融合群进行了多种药剂的毒力筛选，结果发现不同融合群对同一种药剂的敏感性也存在较大差异，并且相同融合群(AG2-1或AG4)内的一些相同菌株对相同药剂敏感性也存在明显的不同[32]。同样，对马铃薯黑痣病病菌的一些融合群(AG2-1、AG3、AG4和AG5)进行药剂毒力测定及筛选时，相同融合群及其内部也存在很大的差异[1,13,33]。因此，应根据云南省马铃薯黑痣病病原菌的变化及时调整防治策略。

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(责任编辑：杨明丽)

Anastomosis groups ofRhizoctoniasolaniand toxicity of eight fungicides againstR.solanifrom black scurf of potato

Liu Xia,Feng Rui,Gao Dafang,Wang Dongyue,Yang Yanli

(College of Plant Protection, Yunnan Provincial Key Laboratory of Plant Pathology,Yunnan Agricultural University, Kunming650201, China)

Black scurf of potato (RhizoctoniasolaniKühn) is a kind of soil-borne and tuber-borne disease. The disease occurs in potato production regions of world widely. Identification of anastomosis groups of 67 collected samples showed that all theR.solaniisolates belonged to AG3. ITS sequences analysis on 11 isolates from six regions demonstrated that the similarity of eleven strains was 99%. Toxicity bioassay of eight fungicides showed that 20%flutolanil+azoxystrobin WG and 25 g/L fludioxonil FSC had the strongest inhibition activity againstR.solani, with the control efficiency of 100%.

black scurf of potato;anastomosis group;toxicity

2015-01-13

2015-04-15

云南省现代农业马铃薯产业技术体系(2015KJTX003);云南省科技计划项目(2013ZA006)

E-mail: zqccn@aliyun.com

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.030