新疆榆树黄萎病病原菌鉴定

岳永亮,　任毓忠,　张　莉,　金恭玺,　李国英

(石河子大学农学院, 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室, 石河子　832003)



新疆榆树黄萎病病原菌鉴定

岳永亮,任毓忠,张莉,金恭玺,李国英*

(石河子大学农学院, 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室, 石河子832003)

2013年以来,在石河子大学农学院试验站榆树苗上,出现了一种病害,可导致叶片褪绿,变黄,萎蔫,甚至枯死,剖茎检查可见维管束变成褐色。采用常规组织分离法对病茎组织进行分离、纯化获得单孢纯培养菌株;通过常规纸钵撕底蘸根法对其进行致病性测定;用形态学和rDNA-ITS序列分析方法对病原菌进行鉴定。结果表明,分离菌株的菌落形态、分生孢子梗和分生孢子的形态都与大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)一致;经分子生物学鉴定,该菌的rDNA-ITS序列与中国棉花黄萎病菌(V.dahliae)的ITS序列(登录号EU 835817.1)相似性达99.0%,故将引起新疆榆树黄萎病的病原菌鉴定为大丽轮枝菌(V.dahliae)。

榆树;黄萎病;病原鉴定

榆树(UlmuspumilaL.)属榆科,落叶乔木,主要分布在东北、华北、西北、华东等地。榆树喜光,耐旱,耐寒,耐瘠薄,寿命长,适应性强。木材耐磨,耐腐,是造船、建筑、室内装修地板、家具的优良用材。榆树是我国西北重要的园林绿化树种,广泛用于道路两侧、庭院、公园、工厂等的绿化,也是减轻大气污染物的重要途径和手段[1]。2013—2014年在新疆石河子大学农学院试验站发现一种新的榆树病害,一年生榆树出苗后,在8—9月间叶片主要自下而上出现褪绿,变黄,萎蔫,有些叶脉间组织褪绿后发生枯死,叶片逐渐脱落,严重者出现顶枯。剖茎检查可见维管束变褐色。为了搞清其病害种类,对其病原进行了鉴定。

1　材料与方法

1.1标本来源及症状描述

标本来源于2013年采自新疆石河子市石河子大学农学院试验站由种子萌发的榆树幼苗病株。通过田间自然发病和人工接种发病植株进行症状描述。

1.2病原菌分离纯化及致病性测定

2013年9月从田间选取榆树幼苗发病茎杆,在无菌条件下,撕去皮层,将病茎维管束切成0.5 cm×0.5 cm的小块,用75%乙醇表面消毒2 min,无菌水冲洗3次,置于PDA培养基上25℃黑暗培养,待长出菌丝后,挑取菌落边缘进行纯化,纯化后的菌落进行单孢分离培养,然后4℃试管斜面保存和-70℃ 20%甘油孢子悬浮液保存,备用。病原菌的致病性测定参照马存等[2]的纸钵撕底蘸根法进行接种。榆树幼苗采用种子繁殖,55℃温汤浸种24 h,播入装有无菌土的直径12 cm×12 cm的营养钵,置于25～30℃的温室。当幼苗长到4片真叶时用孢子浓度1×107个/mL新鲜菌液15 mL接种榆树苗根部,以接15 mL无菌水为对照,设3个重复。待植株发病后对病原菌进行再分离,对植株的发病情况进行详细记载。

1.3形态学鉴定

将-70℃保存的病原菌在PDA培养基上活化7 d,在无菌操作下用灭菌的直径为7 mm的打孔器在活化菌落边缘打7 mm的菌饼,挑到新PDA平板的中央。分别置于10、15、20、25、30℃和35℃温度下的6个光照培养箱中黑暗培养,每2 d观察记录一次,16 d后结束。观察病原菌在PDA平板上的菌落特征、微菌核产生情况、分生孢子梗和分生孢子的形态及大小,并进行显微测量。

1.4分子生物学鉴定

1.4.1DNA提取

病原菌DNA的提取采用宝生物工程(大连)有限公司生产的Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR试剂盒进行提取。

1.4.2rDNA-ITS区的扩增及测序

采用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4扩增菌株rDNA-ITS区段。引物序列:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR反应体系25 μL,其中,引物ITS1(10 μmol/L)1 μL,引物ITS4(10 μmol/L)1 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL,模板DNA 1 μL,加ddH2O至25 μL。PCR扩增反应程序:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸40 s,30个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。取5 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在紫外透射仪下检测PCR产物大小,DNA marker为DL2000。扩增产物直接进行测序。

1.4.3rDNA-ITS序列比较分析

测序后序列经校正后,在NCBI数据库GenBank中进行同源序列搜索,比较测试菌株与数据库中相应序列的相似性。

2　结果与分析

2.1病害症状

榆树在田间出苗后,该病害一般在9月份开始发病,病初症状常从叶片边缘开始,叶脉间的组织出现褪绿、叶片自下而上黄化,严重者整株叶片变黄,顶端枯死,剖茎检查维管束变成褐色,和棉花黄萎病的症状有些类似,但发病明显比棉花黄萎病要晚,且以黄化枯死为主。室内人工接种后,一般50 d后常从叶片边缘开始,其叶脉间的叶肉发黄,叶片自下而上出现黄化,重者叶片逐渐干枯脱落,造成整株萎蔫。剖茎检查病株维管束变褐色。接种症状和田间症状一致(图1a、b、c)。

图1　榆树黄萎病症状Fig.1　Symptoms of Verticillium wilt in elm

2.2致病性

室内接种植株表现出与大田发病植株相同的症状,未接种对照植株表现正常。从接种发病榆树幼苗植株上进行再分离,分离到与接种菌株相同的病原菌。

2.3形态学鉴定

病原菌在PDA培养基上培养16 d后,菌落为近圆形。但在不同温度下其菌落特征有一定区别。在10、15、20、25℃菌落边缘光滑并有白色环带,产生微菌核,有明显或不明显的放射状褶皱,气生菌丝白色或鼠灰色,不发达;在20℃时有明显的同心轮纹;在25℃生长最快,20℃次之。在30℃不产生微菌核,菌落正面呈规则的放射状乳白色,且菌丝较少,背面米黄色。35℃下不生长(图2a)。普通显微镜观察分生孢子梗无色透明,多由1～3层轮生小梗和一个顶枝组成,每层有3～4个分枝(图2 b),顶枝小梗大小32.5 ～87.5 μm,平均49.3 μm;轮枝小梗大小17.5 ～40.0 μm,平均26.75 μm;轮层间距大小为30.0～67.5 μm,平均45.4 μm。分生孢子无色透明,椭圆形、卵形等,大小为(5.0～7.5)μm×(2.5～5.0)μm,平均6.0 μm×3.3 μm,湿度大时在小梗顶端聚集成假头状。微菌核念珠状、椭圆形、长圆形或不规则形(图2 c),大小差别很大,一般(30.0～100.0)μm×(22.5～50.0)μm,平均58.0 μm×34.0 μm。形态学鉴定与已报道的大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)一致。

图2　榆树黄萎病病原菌的形态Fig.2　Morphology of the pathogen causing Verticillium wilt in elm

2.4分子生物学鉴定

使用通用引物ITS1和ITS4对病原菌rDNA-ITS区进行PCR扩增,可扩增出大小为496 bp的片段。将扩增产物测序所得序列与GenBank数据库中核苷酸数据进行BLAST比对分析,该序列与已报道的来自中国棉花的V.dahliae序列(登录号 EU 835817.1)相似性达99.0%。

3　讨论

2013—2014年对新疆石河子大学农学院试验站试验田进行调查时发现,田间由榆树种子萌发的幼苗在8、9月间常发生一种叶片褪绿,变黄,萎蔫,后期枯死的病害,剖茎检查其维管束变成褐色。通过病原菌形态观察、致病性测定和分子生物学鉴定,证明它们是由大丽轮枝菌(V.dahliae)引起的榆树黄萎病。大丽轮枝菌是一种典型的土传病害,具有寄主多、分布广的特点,可危害38科660种植物,常引起多种植物黄萎病[3-4],但榆树黄萎病病原鉴定未见报道。经初步试验,从榆树幼苗病株中分离的这种大丽轮枝菌,还可侵染棉花、绿豆和红花等。发现榆树幼苗黄萎病的田间,其前茬是棉花黄萎病重病田。据报道,目前新疆棉花黄萎病发生较重[5-6],为此在棉花黄萎病重病田轮作倒茬时不要进行榆树苗的繁殖,以免引起经济损失。有关榆树幼苗黄萎病在新疆的发生情况和棉花黄萎病的关系及其防治等有待进一步研究。

[1]鲁敏,姜凤岐.绿化树种对大气 SO2、铅复合污染反应[J]. 城市环境和城市生态,2004,16(6):23-25.

[2]马存.棉花枯萎病与黄萎病[M]. 北京:中国农业出版社,2007:61-106.

[3]Pegg G F,Brady B L.Verticilliumwilts [M].UK:CABI Publishing, 2002.

[4]Chen W. Vegetative compatibility groups ofVerticilliumdahliaefrom ornamental woody plants [J]. Phytopathology, 1994,84:214-219.

[5]韩宏伟,刘培源,吉丽丽,等.新疆北部棉区棉花黄萎病菌病原种群致病性分化及变异[J]. 植物保护学报,2011,38(2):121-126.

[6]韩宏伟,任毓忠,刘培源,等.新疆南部棉区黄萎病菌种群致病性分化及变异[J]. 棉花学报,2012,24(2):147-152.

(责任编辑：田喆)

Identification of the pathogen causingVerticilliumwilt onUlmuspumilain Xinjiang

Yue Yongliang,Ren Yuzhong,Zhang Li,Jin Gongxi,Li Guoying

(College of Agriculture, Shihezi University, Key Laboratory at Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricultural Pest Management and Plant Protection Resource Utilization, Shihezi832003, China)

Since 2013, symptoms of chlorosis, yellowing, and wilting were observed on the leaves of elm seedlings in a plantation at an experiment station near Shihezi University in Xinjiang Uygur Autonomous Region. Some of the seedlings eventually died. Vascular discoloration was observed when the infected plants were dissected. The pathogen was isolated from the infected tissue, and pathogenicity of the isolate was tested by paper pots tear bottom dipping root methods.The isolate was identified based on their pathogenicity, morphology, and sequence analysis of rDNA-ITS. The colony morphology, conidiophores, and conidia of the isolates were identical toVerticilliumdahliae. The rDNA-ITS sequence showed 99.0% homology with that of China cotton isolate ofV.dahliae(Accession EU835817.1). Thus, the pathogen causingVerticilliumwilt in elm was confirmed asV.dahliae.

elm;Verticilliumwilt;identification of pathogen

2015-02-06

2015-04-08

科技部中小企业创新项目(14C26216513812);石河子科技局地方基金项目(2012NY04)

E-mail:lgyshzu@163.com

S 763.13

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.048