3种丝柏油醇络合物对11种植物病原真菌的室内抑菌活性

罗小勇,　徐　丹,　杨从军,　邢小霞,　宋吉青

(1. 青岛农业大学农学与植物保护学院, 山东省农作物病虫害综合防控重点实验室,青岛　266109; 2. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 农业部农业环境气候变化重点开放实验室, 农业部旱作节水农业重点开放实验室, 北京　100081)



3种丝柏油醇络合物对11种植物病原真菌的室内抑菌活性

罗小勇1,徐丹1,杨从军1,邢小霞1,宋吉青2*

(1. 青岛农业大学农学与植物保护学院, 山东省农作物病虫害综合防控重点实验室,青岛266109; 2. 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所, 农业部农业环境气候变化重点开放实验室, 农业部旱作节水农业重点开放实验室, 北京100081)

采用生长速率法测定了丝柏油醇铜、钙、钠3种络合物对11种常见植物病原真菌菌丝生长的抑制作用。结果表明,3种丝柏油醇络合物对小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、柑橘炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌、西瓜炭疽病菌、苹果斑点落叶病菌、大葱紫斑病菌、玉米纹枯病菌和番茄灰霉病菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用,其中对棉花枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制效果相对较高,EC50分别为21.69～27.13 mg/L和25.18～29.43 mg/L。而3种络合物对其他病菌的EC50，除钙络合物对柑橘炭疽病菌和西瓜炭疽病菌、钠络合物对柑橘炭疽病、西瓜炭疽病菌和小麦赤霉病菌的EC50高于50 mg/L外,均小于等于45.72 mg/L。说明3种丝柏油醇络合物均具有防治上述植物病害的潜力,但以铜络合物的活性相对较高。

丝柏油醇络合物;植物病原真菌;抑菌作用

农作物真菌病害的防治长期以来一直依赖于人工合成的化学药剂,其不但污染环境而且残留严重,对人体易造成伤害,因此,寻求既能有效防治农作物病害又能保护环境的新型杀菌剂备受关注[1-3]。植物源农药因其来源于天然产物,具有安全、无污染、对环境友好等优点[1-3]。目前,国内外利用植物源杀菌剂杀菌的报道较多[1-3],其中,孟昭礼等[4-5]从银杏中分离出对植物病原真菌具有高活性的化合物白果酚,并人工模拟合成开发出了银果、银泰和仿生胺3种农用杀菌剂。1936年旅台学者野副鉄男从台湾丝柏中分离得到一种具有强抗菌活性的化合物丝柏油醇(C10H12O2),亦称日扁柏醇(hinokitiol)[6-7]。该化合物对各种细菌具有很强的抗菌活性,已广泛应用于医药、化妆品以及食物保鲜等领域[7-8];但因其光、热稳定性差、极难溶于水以及对金属具有极强的腐蚀性,应用的范围在一定程度上受到限制[8]。宋吉青等研究发现,将丝柏油醇与金属结合形成金属化合物后,可从根本上改善其遇光易分解的问题,并制备得到丝柏油醇-Na、Ni、Ca、Cu、Zn、Ag、Mn、Fe等络合物,这些化合物对真菌、细菌和线虫等呈现出显著的抑抗活性。大田试验时每667 m2施用1g丝柏油醇防治大豆菌核病达85%的良好效果[9-10]。为了进一步发掘丝柏油醇在农业上防治农作物真菌病害的潜力,本研究对其铜、钙和钠3种络合物的抑菌活性进行了室内测定。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1供试药剂

丝柏油醇铜、丝柏油醇钙和丝柏油醇钠均由中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所提供。

1.1.2供试菌种

小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminisvar.triticiWalker)、小麦赤霉病菌[Gibberellazeae(Schw.) Petch]、柑橘炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.)Penz. & Sacc.]、苹果轮纹病菌[Botryosphaeriadothidea(Moug.) Ces.etDe Not]、黄瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporum(Schl.) f.sp.cucumerinumOwen]、棉花枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Sndyder & Hansln]、西瓜炭疽病菌[Colletotrichumorbiculare(Berk. & Mont.) Arx]、苹果斑点落叶病菌(Alternariaalternataf.sp.mali)、大葱紫斑病菌[Alternariaporri(Ellis) Ciferri]、玉米纹枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)和番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)菌种均由青岛农业大学农药学实验室采集和保存。

1.2方法

1.2.1抑菌作用测定

采用生长速率法测定丝柏油醇络合物对供试病原真菌的抑制作用。取灭菌培养皿,每皿倒入15 mL熔化的PDA培养基制成平板。挑取一小块各供试菌种分别放入PDA平板中央,置于25℃恒温箱内培养,待平板上长满菌丝后,用灭菌打孔器(直径3 mm)在菌落上打取菌饼用于生物测定。

将3种丝柏油醇络合物用无水乙醇溶解后,分别配制浓度梯度为10、20、30、40和50 mg/L的含药PDA培养基50 mL,冷凝前分别快速均匀倒入3个灭菌的培养皿中,其中乙醇的最终浓度均为0.5%。以 含0.5%乙醇的PDA培养基为空白对照,重复3次。

用接种针挑取菌饼接种于含药PDA平板中央,每皿一块菌饼,菌丝面向下。将接种后的培养皿用保鲜膜密封保湿。而后放入25℃培养箱中培养,3～4 d后采用十字交叉法测定各培养皿中菌落直径,计算菌落纯生长量及抑制率。

菌落纯生长量=菌落直径-菌饼直径(3 mm)；

抑菌率(%)=

1.2.2毒力计算

采用剂量对数-几率值回归线(LD-P)法分别求出3种丝柏油醇络合物对11种植物病原真菌菌丝生长的毒力回归方程,计算抑菌中浓度(EC50)、抑制10%菌丝生长所需浓度(EC10)及抑制90%菌丝生长所需浓度(EC90)。试验数据采用Microsoft Excel软件处理,并采用SPSS 20统计软件进行方差分析和线性回归分析。

2　结果与分析

3种丝柏油醇络合物对11种农作物病原真菌的抑菌活性如表1和表2所示。在10～50 mg/L的浓度处理下,其铜、钙和钠络合物对供试的植物病原真菌均表现出不同程度的抑制活性,且抑制率均随处理浓度的增加而提高。

表1　3种丝柏油醇络合物对11种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用1)

续表1Table 1 (Continued)

病原菌Fungus浓度/mg·L-1Concentration抑菌率/% Inhibitionrate丝柏油醇铜Hinokitiol-Cu丝柏油醇钙Hinokitiol-Ca丝柏油醇钠Hinokitiol-Na玉米纹枯病菌Rhizoctoniasolani10(14.73±0.93)aE(14.11±0.62)aE(13.81±0.67)aE20(23.24±0.95)abD(26.97±1.18)aD(21.92±0.78)bD30(39.83±0.18)bC(41.21±0.29)aC(39.83±0.18)bC40(51.04±1.00)aB(47.30±0.36)bB(44.40±0.48)cB50(60.58±0.48)bA(50.21±0.31)cA(66.39±0.31)aA番茄灰霉病菌Botrytiscinerea10(12.82±0.40)aE(7.69±1.26)bE (9.09±1.21)abE20(17.95±0.81)aD(12.12±0.73)bD(19.35±0.40)aD30(49.42±1.23)aC(24.50±2.44)bC(50.58±1.62)aC40(89.51±0.61)aB(87.88±0.53)aB(73.89±0.81)bB50(96.27±1.76)aA(96.50±0.70)aA(94.41±0.00)aA

1) 表中数据为三次重复平均值±标准误。每种病原菌的同列不同大写字母或同行不同小写字母分别表示不同浓度处理或三种络合物之间在0.05水平上差异显著。Data in the table are mean±SE (n=3). Different capital letters in the same column indicated significant differences among different concentrations and different lower case letters in the same row indicated significant differences among the three compounds at 0.05 level, respectively.

对小麦全蚀病菌,丝柏油醇铜、钙和钠络合物在10～50 mg/L处理浓度下的抑菌率分别达12.22%～86.67%、9.49%～86.75%和8.55%～91.89%,均表现出较强的抑菌活性。同一浓度下不同络合物的抑菌率差异较大(表1)。三种络合物的EC50分别为29.04、29.97和28.97 mg/L,EC10分别为11.64、13.15和14.96 mg/L(表2)。

对小麦赤霉病菌,丝柏油醇铜、钙和钠络合物在10～50 mg/L处理浓度下的抑菌率分别为3.39%～77.40%、11.30%～73.73%和16.02%～43.22%,低于对小麦全蚀病菌的抑制率。尽管钠络合物在10 mg/L的低浓度下抑制率明显高于铜和钙络合物,但随着浓度的增加,其抑菌活性的提高幅度明显低于其他两种络合物(表1)。其铜、钙和钠络合物的EC50(EC10)分别为34.31(17.00)、34.80(11.29)和>50 mg/L(7.58 mg/L)(表2)。

对柑橘炭疽病菌,丝柏油醇铜、钙和钠络合物的抑菌活性均较低,在10～50 mg/L处理浓度下的抑菌率分别只有13.17%～67.90%、12.55%～44.44%和5.99%～49.79%。同一浓度下不同络合物相比,铜络合物的抑菌效果明显较高,除在30 mg/L处理下与钠络合物无显著性差异外,其余浓度下与钙、钠络合物存在显著差异,而钙和钠络合物的抑菌率差异较大(表1)。三种络合物的EC50(EC10)分别为39.10(10.37)、>50(10.54)和>50 mg/L(13.83 mg/L)(表2)。

对苹果轮纹病菌,丝柏油醇铜、钙和钠络合物均表现出较高的抑制活性,在10～50 mg/L处理浓度下的抑菌率分别达23.48%～91.94%、22.04%～75.81%和28.57%～72.76%,且均随处理浓度的增加而显著提高。尽管在10 mg/L的低浓度处理下,钠络合物的抑制率明显高于其他两种络合物,但当浓度增加至20 mg/L后,铜络合物的活性显著增加,明显高于钠和钙络合物,而钠络合物除了在50 mg/L处理下与钙络合物差异不显著外,其余浓度处理均明显高于钙络合物(表1)。铜、钙和钠络合物的EC50(EC10)分别为20.39(7.18)、33.43(7.12)和29.13 mg/L(4.44 mg/L)(表2)。

对黄瓜枯萎病菌,丝柏油醇铜、钙和钠络合物在10～50 mg/L处理浓度下的抑菌率分别达11.93%～86.36%、5.11%～100.00%和0.50%～96.71%,且均随处理浓度的增加而明显提高。但三者在10 ～40 mg/L的低浓度下,所表现出的抑菌率均相对较低,40 mg/L时抑菌率仅为38.07%、40.34%和53.59%,当浓度增加至50 mg/L时抑菌率才分别倍增至86.36%、100.00%和96.71%。同一浓度下不同络合物相比,抑菌率变化较大(表1)。三者的EC50(EC10)分别为34.84(11.17)、32.69(15.92)和36.41 mg/L(25.32 mg/L)(表2)。

对棉花枯萎病菌,丝柏油醇铜、钙和钠络合物均表现出较高的抑菌活性,在10～50 mg/L处理浓度下的抑菌率分别达5.17%～98.65%、8.31%～94.38%和15.22%～89.21%,且均随处理浓度的增加而明显提高。同一浓度下不同络合物相比,在10～30 mg/L浓度下钠络合物的抑菌活性明显高于铜和钙络合物,尤其是在30 mg/L浓度下其抑菌率高达83.82%,远高于铜络合物(46.07%)和钙络合物(48.58%)，但在40 mg/L处理下与铜、钙络合物无显著性差异。当浓度增加至50 mg/L时以铜络合物抑菌率最高,钙络合物次之,钠络合物最低,三者间差异显著(表1)。铜、钙和钠络合物的EC50(EC10)分别为26.73(15.63)、27.13(14.63)、和21.69 mg/L(10.12 mg/L)(表2)。

对西瓜炭疽病菌,只有铜络合物的抑菌效果较好,达到了11.73%～79.65%,而钙和钠络合物均较低,分别只有2.21%～37.17%和2.73%～33.85%。同一浓度下不同络合物相比,铜络合物的抑制活性显著高于其他两种络合物,而钙和钠络合物相比除40 mg/L处理下钙络合物抑菌率显著高于钠络合物外,其余均无显著性差异(表1)。铜、钙和钠络合物的EC50(EC10)分别为24.99(8.60)、>50(20.73)和>50 mg/L(21.49 mg/L)(表2)。

对苹果斑点落叶病菌,尽管其三种络合物在10～40 mg/L浓度处理下的抑菌活性均较低,铜、钙和钠络合物抑菌率分别只有6.20%～46.09%、3.77%～47.17%和3.32%～35.31%,但在50 mg/L的高浓度下分别提高到73.58%、100.00%和100.00%。同一浓度下不同络合物相比,抑菌率变化较大(表1)。三者的EC50(EC10)分别为38.26(14.90)、35.34(20.58)和38.16 mg/L(22.57 mg/L)(表2)。

对大葱紫斑病菌,其铜、钙和钠络合物的抑菌活性均相对较低,在10～50 mg/L浓度处理下的抑菌率分别只有8.99%～73.03%、15.73%～69.66%和8.20%～69.66%,但各浓度处理间均达差异显著水平。同一浓度下不同络合物相比,除在30 mg/L和50 mg/L处理下三种络合物的抑菌率间无显著差异外,其余浓度下差异性较大(表1)。三者的EC50(EC10)分别为34.09(12.36)、38.97(8.70)和40.92 mg/L(14.36 mg/L)(表2)。

对玉米纹枯病菌,铜、钙和钠络合物的抑菌活性尽管各浓度处理间差异显著,但均相对较低,在10～50 mg/L浓度下的抑菌率分别只有14.73%～60.58%、14.11%～50.21%和13.81%～66.39%。同一浓度下不同络合物相比,抑菌率差异性较大(表1)。虽然三者的EC10均低于10 mg/L,分别为8.80、7.31和9.66 mg/L,但它们的EC50均较高,分别达39.35、45.72和39.37 mg/L(表2)。

对番茄灰霉病菌,其铜、钙和钠络合物在10～30 mg/L的低浓度下抑菌率相对较低,分别只有12.82%～49.42%、7.69%～24.50%和9.09%～50.58%,但浓度增加至40 mg/L后,活性明显增强,在50 mg/L的处理浓度下抑菌率分别高达96.27%、96.50%和94.41%,且各浓度处理间差异显著。同一浓度下不同络合物相比,除在50 mg/L处理下三种络合物的抑菌率无显著差异外,其余浓度下差异较大(表1)。铜、钙、钠络合物的EC50均较低,分别只有25.18、29.43和27.31 mg/L,EC10也分别达12.67、16.39 和13.34 mg/L(表2)。

铜、钙和钠络合物对11种植物病原真菌菌丝生长的EC90(抑制90%病菌生长所需浓度)除对棉花枯萎病分别为45.68、50.32 和46.49 mg/L外,其余均明显高于50 mg/L。

表2　3种丝柏油醇络合物对11种植物病原真菌菌丝生长抑制活性的回归分析

续表2Table 2 (Continued)

病原菌Fungus丝柏油醇络合物Hinokitiolclathrates回归方程Regressionequation相关系数(r)CorrelationcoefficientEC10/mg·L-1EC50/mg·L-1EC90/mg·L-1棉花枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum铜络合物y=5.504x-7.8540.94715.6326.7345.68钙络合物y=4.777x-6.8480.93314.6327.1350.32钠络合物y=3.870x-5.1710.93310.1221.6946.49小麦赤霉病菌Gibberellazeae铜络合物y=4.205x-6.4560.97417.0034.31>50钙络合物y=2.622x-4.0420.94711.2934.80>50钠络合物y=1.235x-2.3680.9307.58>50>50西瓜炭疽病菌Colletotrichumorbiculare铜络合物y=2.766x-3.8660.9948.6024.99>50钙络合物y=2.465x-4.5270.99020.73>50>50钠络合物y=2.046x-4.0080.94421.49>50>50苹果斑点落叶病菌Alternariaalternata铜络合物y=3.129x-4.9530.95914.9038.26>50钙络合物y=5.458x-8.4510.90620.5835.34>50钠络合物y=5.618x-8.8850.91022.5738.16>50大葱紫斑病菌Alternariaporri铜络合物y=2.909x-4.4580.97912.3634.09>50钙络合物y=1.967x-3.1300.9098.7038.97>50钠络合物y=2.818x-4.5420.94114.3640.92>50玉米纹枯病菌Rhizoctoniasolani铜络合物y=1.970x-3.1420.9778.8039.35>50钙络合物y=1.610x-2.6730.9907.3145.72>50钠络合物y=2.100x-3.3500.9559.6639.37>50番茄灰霉病菌Botrytiscinerea铜络合物y=4.298x-6.0220.91312.6725.18>50钙络合物y=5.042x-7.4050.87616.3929.43>50钠络合物y=4.118x-5.9140.94713.3427.31>50

3　讨论与结论

上述研究结果表明,丝柏油醇的3种络合物对11种常见的植物病原真菌菌丝的生长均有不同程度的抑制作用,对棉花枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制作用相对较强。三种络合物对各种病原菌的抑制活性差异较大,既体现在EC50的不同,也体现在EC10的不同。根据EC50分析,3种络合物对小麦全蚀病菌的效果基本相当;对柑橘炭疽病菌，铜络合物的效果明显高于钙和钠络合物;对苹果轮纹病菌和番茄灰霉病菌以铜络合物的效果最高,钠络合物次之,钙络合物较低;对黄瓜枯萎病菌以钙络合物的效果最高,铜络合物次之,钠络合物较低;对棉花枯萎病菌以钠络合物的效果最高,铜和钙络合物次之;对小麦赤霉病菌铜和钙络合物的效果相当,均高于钠络合物;对西瓜炭疽病菌铜络合物的效果明显高于钙和钠络合物;对斑点落叶病菌以钙络合物的效果最高,铜和钠络合物次之;对大葱紫斑病菌以铜络合物的效果最高,钙络合物次之,钠络合物较低;对玉米纹枯病菌铜和钠络合物的效果相当,但明显高于钙络合物。除钙络合物对柑橘炭疽病菌和西瓜炭疽病菌、钠络合物对柑橘炭疽病菌、西瓜炭疽病菌和小麦赤霉病菌的EC50高于50 mg/L外,其余均在20.39～45.72 mg/L之间。说明3种丝柏油醇络合物均具有农用防除上述植物病原真菌的潜力,且铜络合物的活性相对较高。但由于药剂的作用受很多因素的影响,其室内毒力测定结果和田间药效未必完全一致,因此,还有待于做进一步的田间防治效果试验。

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(责任编辑：杨明丽)

Antagonism of three kinds of hinokitiol clathrates against eleven kinds of plant pathogenic fungi

Luo Xiaoyong1,Xu Dan1,Yang Congjun1,Xing Xiaoxia1,Song Jiqing2

(1. College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University; Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province, Qingdao266109, China; 2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Environment & Climate Change, Ministry of Agriculture,Key Laboratory of Dryland Farming and Water-Saving Agriculture, Ministry of Agriculture, Beijing100081, China)

Inhibitory effects of three hinokitiol clathrates on hypha growth of 11 kinds of plant pathogenic fungi, includingGaeumannomycesgraminisvar.triticiWalker,Gibberellazeae(Schw.) Petch.,Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Penz. & Sacc.,Botryosphaeriadothidea(Moug.) Ces.etDe Not.,Fusariumoxysporum(Schl.) f.sp.cucumerinumOwen,F.oxysporumf.sp.vasinfectum(Atk.) Sndyder & Hansln,Colletotrichumorbiculare(Berk. & Mont.) Arx,Alternariaalternataf.sp.mali,A.porri(Ellis) Ciferri,RhizoctoniasolaniKühn. andBotrytiscinereaPers., were determined with mycelium growth rate method. The results showed that the three hinokitiol clathrates had different inhibitory activities against the 11 pathogenic fungi. Among them, the inhibitions of the three compounds onF.oxysporumandB.cinereawere relatively higher, with the median effective concentrations (EC50) of 21.69-27.13 mg/L and 25.18-29.43 mg/L, respectively. The EC50values of three compounds on other pathogen fungi were below 45.72 mg/L, except that hinokitiol-Ca onC.gloeosporioidesandC.orbiculare, and hinokitiol-Na onC.gloeosporioides,C.orbiculareandG.zeae, which were over 50 mg/L. It suggested that the three hinokitiol clathrates may have potential control effects on the above plant diseases, especially hinokitiol-Cu demonstrated higher inhibitory activity.

hinokitiol clathrates;plant pathogenic fungi;antagonism

2015-08-22

2015-09-13

教育部留学回国人员科研启动基金；山东省“泰山学者”建设工程专项

E-mail：songjiqing@caas.cn

S 432

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.042