正交实验法优化屈曲花总黄酮的超声波辅助提取工艺

邓思节,汉斯·格里格森

(重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆 400044)



正交实验法优化屈曲花总黄酮的超声波辅助提取工艺

邓思节,汉斯·格里格森*

(重庆大学生物工程学院,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆 400044)

本文采用正交实验设计法优化了超声波辅助提取屈曲花总黄酮的工艺条件。首先,通过单因素实验研究乙醇浓度、提取时间、料液比和超声波功率对总黄酮得率的影响。然后,利用正交实验设计法优化最佳提取工艺。实验结果表明,乙醇浓度对屈曲花总黄酮得率的影响最大,其次依次为提取时间、料液比、超声波功率。最佳的提取条件为乙醇浓度85%、料液比1∶70、提取时间15 min、超声波功率100 W。在该条件下,总黄酮得率为2.456%。本文为工业化应用提供了参考标准,也为广泛开发利用屈曲花药物资源提供了良好的参考价值。

屈曲花,黄酮,超声波辅助提取,正交实验

屈曲花(Iberisamara)为十字花科屈曲花属一年生草本植物[1-2],又名珍珠球、蜂室花等,原产于南欧,主要集中在地中海区域[1],目前已由人工引种栽培。研究表明,屈曲花鲜植株中富含多种活性成分[1,3-5],如有机胺类、芥子油甙类和黄酮类物质[2-3]。黄酮类物质属于天然多酚类抗氧化剂,可有效清除体内的氧自由基,减缓衰老,也可预防癌症,而且还具有一定的抗菌作用[6]。因此,无论是在药物还是在保健食品方面,屈曲花都有着广阔的应用前景。

提取植物中黄酮类物质时,影响总黄酮得率的因素很多,而且在同一因素的不同水平下的总黄酮得率也会有很大差别。因此,需要综合考虑选择恰当的方法来优化提取工艺。传统的提取中草药黄酮类物质的方法主要有乙醇浸提法[7]、乙醇加热回流提取法[8]、索氏回流法提取[8-9]等。这些方法虽然成本低、操作简单,但是存在着损失大、周期长、工序繁琐、得率低等缺点。近年来出现了许多新工艺,如超声辅助提取[10]、微波辅助提取[11]、超高压提取[12]等。这些新工艺的应用使得中草药的提取既符合传统的中医理论,也使得有效成分的得率提高和达到了纯度提高的目的。相比之下,超声辅助提取不仅高效低廉,而且更易于实现工业化生产。

目前还没有对屈曲花总黄酮提取工艺研究的报道。综合考虑,本文利用超声波辅助提取屈曲花中的总黄酮,并采用正交实验设计对乙醇浓度、料液比、提取时间以及超声功率这四个因素进行验证和全面优化,以确定最佳提取工艺。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

屈曲花种子广州田野风园林绿化有限公司,干燥、粉碎后过60目备用;芦丁标准品Sigma公司;95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为国产分析纯。

KEUV-8500紫外可见分光光度计上海坤科仪器设备有限公司;SB-5200DTD超声清洗仪苏州江东精密仪器有限公司;FW100万能高速粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;FA1204B电子天平上海精密科学仪器有限公司;FD-1D-50压盖挂瓶型真空冷冻干燥机北京医博康实验仪器有限公司;CS101-3ANB电热鼓风干燥箱重庆永生实验仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液与标准曲线

1.2.1.1标准溶液的配制准确称取120 ℃干燥至恒重的芦丁标准品10.00 mg,置于100 mL容量瓶中,加30%乙醇适量,超声处理使溶解,放冷。稀释、定容为0.10 mg/mL的标准溶液,贮存备用。

1.2.1.2标准曲线的绘制精密量取上述芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL分别置入7只25 mL容量瓶中,各加水至6 mL,加5% NaNO2溶液1 mL,摇匀,静置6 min;加10% Al(NO3)3溶液1 mL,摇匀,静置6 min;加入4% NaOH溶液10 mL,定容至刻度,摇匀,放置15 min后立即在510 nm波长处测定吸光度(A),空白为不加入芦丁标准液。以吸光度为横坐标,浓度(C,mg/mL)为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2样品的制备与样品中总黄酮的测定屈曲花种子原材料于60 ℃的烘箱中干燥48 h后,用万能粉碎机将其粉碎,然后真空冷冻干燥成粉,贮藏于干燥器内备用。精密称取2.0000 g屈曲花粉末置200 mL烧杯中,加入20 mL 75%乙醇溶液,功率为200 W间歇式超声波提取20 min,抽滤,加水定容至200 mL,从滤液中取2.0 mL按照1.2.1.2方法测定OD510 nm,并计算总黄酮得率。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1乙醇浓度对屈曲花总黄酮得率的影响精密称取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比 1∶30(g/mL)分别加入体积分数为45%、55%、65%、75%、85%和95%的乙醇溶液,摇匀后静置25 min。设置超声功率80 W提取时间15 min,将提取液抽滤后,加水定容至200 mL,从滤液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法测定屈曲花提取液吸光度,并计算出总黄酮得率。

1.2.3.2提取时间对屈曲花总黄酮得率的影响精密称取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比 1∶30(g/mL)加入75%的乙醇溶液,摇匀后静置25 min。设置超声功率80 W,提取时间分别为5、10、15、20、30和40 min。将提取液抽滤后,加水定容至200 mL,从滤液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法测定屈曲花提取液吸光度,并计算出总黄酮得率。

1.2.3.3料液比对屈曲花总黄酮得率的影响精密称取2.0000 g屈曲花粉末6份,分别加入75%的乙醇溶液20、40、60、80和100 mL,即料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70和1∶80 g/mL,摇匀后静置25 min。设置超声功率80 W,提取时间15 min。将提取液抽滤后,加水定容至200 mL,从滤液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法测定屈曲花提取液吸光度,并计算出总黄酮得率。

1.2.3.4超声波功率对屈曲花总黄酮得率的影响精密称取2.0000 g屈曲花粉末6份,按料液比1∶30(g/mL)加入75%的乙醇溶液,摇匀后静置25 min。设置提取时间15 min,超声功率分别为80、100、120、140、160和180 W。将提取液抽滤后,加水定容至200 mL,从滤液中取2.0 mL按照 1.2.1.2方法测定屈曲花提取液吸光度,并计算出总黄酮得率。

1.2.4正交实验在单因素实验的基础上,选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)和超声波功率(D)四个因素的三个水平进行正交实验,建立L9(34)正交表,见表1,以屈曲花总黄酮得率(Y)为评价指标,采用SPSS statistic 19.0数据分析软件,对实验数据进行分析。

表1　正交设计实验因素与水平Table 1　Factors and levels in the orthogonal design

1.3总黄酮得率的计算

总黄酮得率要根据标准曲线进行计算。每次实验测定屈曲花提取液吸光度并将其换算成总黄酮的质量浓度,而后根据下列公式得出总黄酮得率:

式(1)

式中,C为提取液总黄酮的质量浓度(mg/mL);V为测量时定容体积(mL);V1为检测时所取提取液体积(mL);V2为提取后定容体积(mL);m为屈曲花样品质量(g)。

1.4数据统计分析

所有的实验均重复3次,利用Excel、origin 7.5和SPSS statistic 19.0对实验结果进行分析。

2　结果与讨论

2.1标准曲线

根据1.2.1.2的实验结果,以吸光度为横坐标,浓度(C,mg/mL)为纵坐标,绘制标准曲线。芦丁标准品溶液在实验中的质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系,线性回归方程为:

C=0.0863A-0.0002,R2=0.9996

式(2)

式中,C为芦丁浓度(mg/mL);A为吸光度值。

2.2单因素实验

2.2.1乙醇浓度对屈曲花总黄酮得率的影响由图1可知,乙醇浓度在 45%～85%范围内时,随着乙醇浓度增加,屈曲花总黄酮得率增加,但乙醇浓度超过85%时,屈曲花总黄酮得率反而下降。根据相似相溶原理,极性相近可达到最大溶出度。当乙醇浓度小于85%时,随着乙醇浓度的增大,乙醇对屈曲花颗粒的作用力增强,促进了黄酮类物质在乙醇溶液中的溶解,从而使得总黄酮提取率增加;当乙醇浓度大于85%时,溶剂的极性减弱,与黄酮类物质的极性差距增加,从而导致黄酮类物质溶出率下降,总黄酮提取率反而降低。因此,选取乙醇浓度75%、85%和95%作为正交实验条件。

图1　乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.2.2提取时间对屈曲花总黄酮得率的影响由图2可知,在10 min内,随时间的延长,屈曲花总黄酮提取率几近线性增加。超过10 min后,屈曲花总黄酮不再增加,反而线性下降。随着超声时间的延长,溶剂充分浸透屈曲花颗粒,促进了颗粒中总黄酮的充分溶出,使得总黄酮提取率增加。超声时间过久,超声波的空化效应会破坏某些黄酮类物质并使其分解。因此,选择超声时间5、10和15 min作为正交实验条件。

图2　提取时间对总黄酮得率的影响Fig.2　Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.2.3料液比对屈曲花总黄酮得率的影响由图3可知,料液比在1∶30～1∶60范围内时,屈曲花总黄酮得率随料液比的增加显著提高。其原因可能是随着料液比的增加,屈曲花颗粒与乙醇溶剂之间的接触面也增加,提高了黄酮类物质向溶剂中转移的扩散系数,使得原料中更多的黄酮溶入提取剂中。当料液比超过1∶60 时,黄酮的提取率有明显的下降趋势。因此,选择料液比1∶50、1∶60和1∶70 g/mL作为正交实验条件。

图3　料液比对总黄酮得率的影响Fig.3　Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.2.4超声波功率对屈曲花总黄酮得率的影响由图4可知,当超声波功率在80～100 W时,随着超声波功率的增大,超声波的作用逐渐加强,屈曲花总黄酮得率缓慢增加。当超声波功率达到100 W 时,屈曲花中总黄酮得率达到最大,之后呈下降的趋势。超声功率的增大,促进了黄酮类物质从屈曲花颗粒内部溶出,从而使得总黄酮提取率增大;而较大超声波功率可能使屈曲花中的某些黄酮类成分遭到破坏,导致黄酮得率有所下降。更重要的是,不同超声波功率下的总黄酮得率之间并没有显著性差异。因此,选择超声波功率80、100和120 W作为正交实验条件。

图4　超声波功率对总黄酮得率的影响Fig.4　Effect of ultrasonic power on extraction yield of total flavonoids

2.3正交实验

以单因素实验结果为基础,选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)和超声波功率(D)四个因素为自变量,以屈曲花中总黄酮得率(Y)为指标,根据相应的实验,计算出总黄酮得率,实验方案及结果见表2,方差分析结果见表3。

由表2极差分析可知,影响屈曲花中总黄酮得率的四个因素顺序为:A(乙醇浓度)>B(提取时间)>C(料液比)>D(超声波功率)。方差分析表3显示乙醇浓度对屈曲花中总黄酮得率影响表现极显著(p<0.01),提取时间对屈曲花中总黄酮得率影响表现显著(p<0.05)。正交实验设计得出的最佳提取工艺条件组合为A2B3C3D2,即乙醇浓度为85%,提取时间为15 min、料液比为1∶70和超声波功率100 W。在该优化条件下平行实验3次,总黄酮平均得率为2.456%。

表2　屈曲花黄酮提取工艺L9(34)正交实验方案及结果Table 2　Experimental design and corresponding results of orthogonal design

表3　方差分析结果Table 3　Variance analysis

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00；**为差异极显著(p<0.01),*为差异显著(p<0.05)。

3　结论

本文在单因素实验基础上,利用实验设计软件SPSS statistic 19.0优化了屈曲花总黄酮提取工艺条件。在正交实验设计所选条件范围内,乙醇浓度对屈曲花总黄酮得率的影响最大,其次为提取时间,然后是料液比,超声波功率影响最小。正交实验设计得出的最佳提取工艺条件为乙醇浓度85%、提取时间15 min、料液比1∶70、超声功率100 W。在该优化条件下平行实验3次,总黄酮平均得率为2.456%。

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Optimization on the ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromIberisamarabased on orthogonal experimental design

DENG Si-jie,HANS Gregrensen*

(Key Laboratory of Biorheological Science and Technology,Ministry of Education College of Bioengineering,Chongqing University,Chongqing 400044,China)

Orthogonal experimental design was applied to optimize the extraction process of total flavonoids fromIberisamarausing an ultrasonic-assisted extraction method in this study. The effects of ethanol concentration,extraction time,solid-to-liquid ratio and ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids were investigated by single-factor experiment,and then the extraction conditions were optimized by orthogonal experimental design. The results displayed that the ethanol concentration was the most key factor,followed by extraction time,solid-to-liquid ratio and ultrasonic power,in turn. The best extraction conditions were obtained as follows:ethanol concentration 85%,solid-to-liquid ratio 1∶70,extraction time 15 min and ultrasonic power 100 W. Under these optimized conditions,the yield of total flavonoids fromIberisamarawas 2.456%. This study offered not only a reference standard for industrial applications,but also has a promising prospect and value for widely exploitation and utilization ofIberisamararesource.

Iberisamara;flavonoids;ultrasonic-assisted extraction;orthogonal experiment

2015-06-18

邓思节(1990-),女,硕士研究生,研究方向:天然产物的分离与提取,E-mail:18875208325@163.com。

汉斯·格里格森(1962-),男,博士,教授,研究方向:软组织生物力学及新型医疗器械,E-mail:hag@giome.org。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0275-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.049