五种DNA提取方法对酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比较

肖其胜,杨捷琳,丁卓平,何宇平,*

(1.上海出入境检验检疫局,上海 200135;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)



五种DNA提取方法对酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比较

肖其胜1,2,杨捷琳1,丁卓平2,*,何宇平1,*

(1.上海出入境检验检疫局,上海 200135;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

针对酸奶及菌粉样品,比较多种样品前处理条件,包括取样量、菌粉溶剂及溶菌酶孵育时间等,最大程度去除样品中的脂肪、蛋白质及多糖,比较五种DNA提取试剂盒对益生菌DNA的提取效果。提取的DNA经NanoVue Plus测定浓度和纯度,PCR扩增综合评价提取效果。结果显示,酸奶取样量为100 mg时DNA浓度为49.00 ng/μL,A260/A280比值为1.8;采用纯牛奶溶解菌粉更为彻底,0.5 g/mL牛奶溶解菌粉后,提取DNA浓度可达到81.00 ng/μL;溶菌酶最佳孵育时间为1 h,增加孵育时间对细菌裂解没有明显帮助。同时,采用五种试剂盒所提取的DNA浓度均在20 ng/μL以上,A260/A280比值大于1.8或接近1.8,其中,Tiangen试剂盒提取的DNA浓度和纯度综合评价优于其他4种试剂盒。结果表明,实验建立的前处理方法能够有效的去除酸奶及菌粉中的脂肪、蛋白质及多糖,提高DNA提取的浓度及纯度;采用的五种商品化试剂盒均能用于酸奶和菌粉中益生菌DNA快速提取,在步骤、得率及纯度上各有差异,应按照不同的实验要求进行选择。

酸奶,乳酸菌菌粉,样品前处理,DNA提取,比较,PCR

益生菌是对人体肠道健康有益的一类微生物,大多属于乳酸菌属[1],广泛应用于酸奶、奶酪、膳食补充剂等食品及保健品生产。越来越多研究证实乳酸菌具有控制肠道感染,改善乳糖的利用率,降低血清胆固醇水平等功效[2-3]。

乳酸菌具有“种”或“株”决定性的特点[4]。我国规定可用于食品及保健品生产的乳酸菌共有21种,包括双歧杆菌6种,乳杆菌14种,链球菌1种,而在婴幼儿食品中可使用的菌株仅有6株。建立一套对益生菌制品中乳酸菌方便、快速、准确的菌株鉴定和溯源方法十分迫切。

目前,分子生物学技术在乳酸菌菌株鉴定和溯源中应用广泛[5]。常见的分子分型技术是将样品接种到固体培养基上分离单菌落,再对单菌落进行扩大培养抽提DNA,但此类方法不利于样品中低丰度细菌种类的分离,不能准确反映复合菌种样品中菌株的真实状态[6-7]。在酸奶等乳制品中,蛋白质和脂肪含量较高,会影响DNA提取的质量和得率;在菌粉等食品添加剂产品中,会使用大量麦芽糊精作为乳酸菌载体,这类多糖物质的理化性质与DNA相似,在提取过程中较难去除,含量较多时会严重影响分子生物学研究的下游工作[8-9]。因此,近年来对于如何去除杂质,提高DNA提取质量研究较多。Parayre等[10]使用2%柠檬酸钠溶液对酸奶进行前处理去除脂肪后再提取DNA,产物得率较低,但纯度能够满足实验需求;宋帆[11]比较了异硫氰胍法、滤膜法和磁珠法提取奶粉中DNA,发现磁珠法提取的奶粉DNA质量较好;Pirondini等[12]使用7种DNA提取方法提取酸奶中DNA,仅CTAB法的扩增条带较为清晰。

本研究以酸奶和乳酸菌粉这两种食品类乳酸菌制剂作为研究对象,比较多种样品前处理条件,包括取样量、菌粉溶剂及溶菌酶孵育时间等,最大程度去除样品中的脂肪、蛋白质及多糖,并比较和评价五种商用试剂盒的DNA提取效果,以期为后续分子生物学实验打下基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

某品牌酸奶(添加菌株:保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌双乙酰亚种);双蒸水;纯牛奶(用于菌粉的溶解稀释)购自超市;双歧杆菌菌粉(添加菌株:乳双歧杆菌-Bb12;8×108CFU/g)由上海丹尼斯克公司提供;柠檬酸三钠二水、氢氧化钠、异丙醇、无水乙醇购自生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白酶K(20 mg/mL)、溶菌酶溶液(50 mg/mL)、TaKaRa Ex TaqTM PCR试剂、琼脂糖、溴化乙锭EB、1×TE(Cat.#DP324-03)、50×TAE Electrophoresis buffer(Fermentas)、DL 2000TMDNA Marker购自天根生化科技有限公司;试剂盒1:Tiangen深加工食品基因组DNA提取试剂盒(Cat.#DP326)，试剂盒3:Tiangen细菌基因组DNA提取试剂盒(Cat.#DP302-02)天根生化科技有限公司;试剂盒2:Roche High Pure PCR Template Preparation Kit(Cat.#11796828001)罗氏诊断产品(上海)有限公司;试剂盒4:Invitrogen Pure Link® Genomic DNA Kits(Cat.#K1820-01)赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;试剂盒5:Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit(Cat.#69504)上海嘉合生物科技有限公司。

BP310S电子天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;5415R冷冻离心机、恒温振荡孵育器、Mastercycler pro梯度PCR仪艾本德中国有限公司;涡旋振荡器德国海道夫仪器公司;NanoVue Plus微量分光光度计上海汇检菁英科技有限公司;BIO-RAD-200/2.2电泳仪、CLP-75.2314电泳槽伯乐生化仪器公司;ALPHA 2S-2200凝胶分析成像系统安莱科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品前处理酸奶:分别称取10、20、50、100、500 mg酸奶于2 mL离心管,加入750 μL去离子水、100 μL 18%柠檬酸钠和50 μL 1 mol/L氢氧化钠。4 ℃,12000 r/min离心5 min,弃上清,保留沉淀[13]。向沉淀加入180 μL溶菌酶,分别孵育1、3、5 h。

菌粉:分别称取0.15、0.5、1、1.5 g菌粉于15 mL离心管,采用1 mL去离子水或1 mL纯牛奶作为溶剂,比较两者作为溶剂对DNA提取效果的影响。后续依次加入7.5 mL去离子水、1 mL 18%柠檬酸钠和500 μL 1 mol/L氢氧化钠,缓冲液有助于去除杂质。4 ℃,12000 r/min离心10 min。弃上清,吸取750 μL去离子水,反复吹打沉淀,使菌体均匀分散于水相,并转移至新2 mL离心管中,依次加入100 μL 18%柠檬酸钠、50 μL 1 mol/L氢氧化钠,4 ℃,12000 r/min离心10 min,弃上清,保留沉淀。向沉淀加入180 μL溶菌酶,孵育1 h。

1.2.2DNA提取使用提取试剂盒抽提上述两组样品中DNA,操作步骤见各试剂盒说明书。每种试剂盒每组样品设置3个平行样。每次提取均设置提取空白对照。

1.2.3样品DNA浓度和质量测定采用微量分光光度计(GE公司NanoVue Plus)分别测定DNA在230、260、280 nm的吸光值,计算A260/A230和A260/A280比值,作为DNA浓度和纯度的判定指标,评估提取的DNA溶液中脂肪、蛋白质及多糖等杂质的去除情况。

1.2.4PCR扩增

1.2.4.1引物采用乳酸菌特异性引物HDA2(5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)和Lac19(5′-A GCAGTAGGGAATCTTCC-3′)[14]扩增酸奶样品中乳酸菌16S rRNA基因可变区,扩增片段大小为200 bp。采用双歧杆菌属16S rDNA tuf基因的引物Bif_tuf_F(5′-GTCCGTGACCTCCTCGAC-3′)和Bif_tuf_R(5′-GTGGAAGGTCTCGATGGAG-3′)[15]对菌粉中提取双歧杆菌DNA进行扩增,片段大小为339 bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成和纯化。

1.2.4.2PCR扩增采用25 μL体系进行PCR扩增,其中包括12.5 μL TaKaRa Ex Taq预混液,2 μL上下游引物,2.5 μL DNA模板(空白对照用ddH2O补足)。反应条件为:94 ℃ 5 min;30个循环×(94 ℃ 30 S;62 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min);72 ℃ 7 min。

1.2.4.3凝胶电泳检测配制1%琼脂糖凝胶,在PCR扩增产物中加入10X上样缓冲液后混匀上样,以DL 2000分子量标准(天根生化科技(北京)有限公司)作为Marker。调节电压在120 V,电泳30 min后在凝胶成像分析系统拍照留存。

2　结果与分析

2.1取样量对提取效果的影响

酸奶组分别设置6个取样量,10、20、50、100、300、500 mg,最终提取乳酸菌DNA结果见表1,分别为5.42、9.52、23.31、49.00、167.15、282.26 ng/μL,这一结果说明DNA提取量基本与样品取样量成正比。前4个取样量的DNA A260/A280比值在1.8～2.0之间,表明提取的DNA纯度较高;而取样为300 mg和500 mg时,DNA A260/A280比值分别为1.64、1.59,纯度较低。说明加大样品量能提取到较多的目标DNA,同时也会引入更多脂肪、蛋白质等杂质,综合各项指标,100 mg酸奶样品提取乳酸菌DNA的浓度和纯度最佳,故后续实验中酸奶取样量为100 mg。

表1　取样量对酸奶DNA提取效果影响Table 1　Effect of yogurt’s sampling quantity on the extraction of DNA

2.2菌粉溶剂对DNA提取的影响

分别采用去离子水和纯牛奶作为菌粉溶剂。按照同样的浓度溶解菌粉,使用去离子水作为溶剂,离心后难以观察到沉淀,而使用纯牛奶作为溶剂,离心后沉淀较多。用水作为溶剂的菌粉DNA提取浓度极低,因此采用纯牛奶作为溶剂,可使菌粉完全溶解。实验共设置4个取样量,0.15、0.5、1、1.5 g/mL,DNA浓度及A260/A280比值见表2。结果表明,取样量增大时DNA得率增加,但当取样量超过0.5 g/mL时,DNA得率降低;从A260/A280比值看,取样量为1.5 g/mL时,DNA纯度最低,说明样品量在一定范围内与DNA浓度和纯度呈正相关,超过一定范围后单个指标受到影响。

表2　取样量对菌粉DNA提取效果影响Table 2　Effect of LAB powder’s sampling quantity on the extraction of DNA

2.3溶菌酶孵育时间对提取效果的影响

乳酸菌为革兰氏阳性菌,细菌细胞壁较厚,提取DNA多采用溶菌酶裂解。取100 mg酸奶样品,采用溶菌酶37 ℃分别孵育1、3、5 h,使用Tiangen细菌试剂盒同批次提取DNA,结果见表3。结果表明,孵育1、3、5 h后,DNA浓度差异较小,表明溶菌酶孵育时间1 h已经足够裂解细菌,故后续实验中采用1 h孵育。

表3　溶菌酶孵育时间对DNA提取效果的影响Table 3　Effect of incubation time of lysozyme on the extraction of DNA

2.4DNA纯度

采用NanoPlus测定提取DNA的OD260、OD230、OD280 nm,计算DNA纯度,见表4。

纯度的DNA A260/A280比值应接近1.8～2.0,若比值大于1.8,说明存在RNA;若比值小于1.8,则说明有蛋白质等杂质。五种试剂盒提取的DNA的A260/A280比值都在1.7～2.3之间。其中,Invitrogen试剂盒和Qiagen试剂盒提取DNA A260/A280比值均大于2.1,说明含RNA较多;Roche试剂盒提取酸奶DNA A260/A280比值为1.73,说明有少量蛋白质残留,而提取菌粉DNA A260/A280比值为2.04,说明有少量RNA;Tiangen两种试剂盒提取的各样品中益生菌DNA的A260/A280比值基本在1.8～2.0附近,表明蛋白质和RNA去除效果较好。

A260/A230比值应在2～2.5之间,偏小则说明有盐剩余。5组试剂盒对两种样品提取的目标DNA A260/A230比值均小于2,说明在提取过程中均有不同程度的盐分残留。残留较少的是Tiangen细菌试剂盒,A260/A230比值最接近2,其余试剂盒A260/A230比值均接近1.0～1.5。同时,根据抽提的重复样计算标准偏差,偏差越小,表明试剂盒重复性越好,由结果可看出Tiangen深加工试剂盒和Invitrogen试剂盒重复性更好。

综合判断,Tiangen深加工试剂盒和Tiangen细菌试剂盒提取的DNA纯度最好。

表4　五种方法提取的DNA纯度Table 4　Purity of the extracted DNA samples by five methods

表5　五种方法提取的DNA浓度(ng/μL)Table 5　Concentration of the extracted DNA samples by five methods(ng/μL)

2.5DNA浓度

同等取样量采用等体积洗脱。结果见表5,酸奶样品DNA提取是Tiangen细菌试剂盒浓度最高,为49.00 ng/μL,Roche试剂盒浓度最低,只有20.67 ng/μL。菌粉样品DNA提取是Tiangen细菌试剂盒浓度最高,为81 ng/μL,Roche试剂盒浓度最低,27.67 ng/μL。

2.6PCR扩增分析

将所有提取的DNA作为模板,扩增乳酸菌16S rRNA基因,电泳结果见图1A所示。整体来看,不同试剂盒提取的DNA浓度与扩增条带亮度趋于一致。

同时,将含有双歧杆菌的菌粉组样品DNA作为模板,扩增双歧杆菌属16S rDNA tuf基因,见图1B。结果表明,所有扩增产物在琼脂糖上均能得到一条致密条带,与预期的片段大小339 bp一致,5种试剂盒提取的DNA浓度均能达到PCR扩增要求。

图1　PCR扩增结果Fig.1　Results of PCR注:A、B分别为酸奶组样品和菌粉组样品的PCR结果。泳道1～3,采用Tiangen深加工试剂盒;4～6,采用Roche试剂盒;7～9,采用Tiangen细菌试剂盒;10～12,采用Invitrogen试剂盒;13～15,采用Qiagen试剂盒;16～18,空白对照。M为DL2000分子量标准。

2.7DNA提取试剂盒比较

根据上述分光光度计对提取目标DNA的A260/A280和A260/A230两个比值和浓度的测定结果,以及PCR扩增结果对各DNA提取方法进行综合分析,同时对提取过程的简易程度等其它因素也进行了综合分析和总结,各方法的优缺点归纳于表6。

3　结论与讨论

分子生物学技术已经广泛应用于各类食品溯源和菌株鉴定的检验中。样品处理和DNA提取是检测流程中至关重要的第一步,DNA模板的结构完整性和纯度直接关系后续实验的成功与否。乳酸菌制剂基质成分复杂,蛋白质,脂肪和多糖类含量高,提取方法不得当,会导致杂质无法去除,直接影响DNA提取质量。因此选择合适的前处理方法和提取方法尤为重要。

表6　五种DNA提取试剂盒比较Table 6　Comparison of five DNA extraction kits

本研究建立了前处理方法,能有效去除酸奶及菌粉样品基质中部分杂质,然后比较了5种常用的DNA提取试剂盒对样品DNA的提取效果。根据不同取样量的两组样品,提取到目标DNA浓度及纯度确定了最佳取样量,酸奶为100 mg,乳酸菌粉为0.5 g/mL,样品取样量太低,提取DNA浓度不能满足后续实验,取样太多则会引入更多杂质,影响DNA纯度;采用水作为菌粉溶剂无法得到沉淀,推测原因可能是因为菌粉中含有大量麦芽糊精,单纯用水溶解很难将乳酸菌与麦芽糊精分离,而牛奶中的脂肪对多糖类物质具有一定吸附作用,有利于样品溶解和菌体分离;比较溶菌酶孵育时间的长短,最终确定乳酸菌最适孵育时间为1 h。

通过对DNA中蛋白质和盐分、多糖等杂质去除情况、DNA浓度和得率,以及PCR扩增情况的综合分析结果表明,5种方法均能满足后续PCR鉴定的进行,但不同方法间各有优缺点。5种方法得到目标DNA都有盐分残留,可能的原因之一是因为样品前处理用到柠檬酸钠及氢氧化钠试剂,而酸奶中脂肪含量也较高,当脂肪与试剂发生吸附时可能使盐分残留,导致A260/A230偏低。考虑到实验所用盐试剂和样品基质的复杂性,所以有少量盐残留的前提是能够满足后续的实验要求,如果后续实验盐分残留影响较大,应增加相应的步骤去除盐分。Tiangen细菌试剂盒均能从两种样品中提取浓度和纯度更好的目标DNA,价格也相对便宜;Qiagen试剂盒对菌粉的提取效果要好于酸奶,说明该试剂盒适合多糖含量较高的样品使用。实验室可根据自身条件,选取合适的提取方法。

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Evaluation of five DNA extraction methods for Probiotic yogurt and powder

XIAO Qi-sheng1,2,YANG Jie-lin1,DING Zhuo-ping2,*,HE Yu-ping1,*

(1.Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China;2.College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Yogurt and Lactic acid bacteria(LAB)powder were chosen as samples. The sampling quantities,solvents of LAB powder and incubation time of lysozyme have been optimized to remove fats,proteins and polysaccharides. Then five commercialized DNA extraction kits were compared on their DNA extraction efficiency after sample pretreatment. The quality and quantity of the extracted DNA were evaluated by NanoVue Plus and conventional PCR. It is showed that when the sampling quantity of yogurt was 100 mg,the DNA concentration was 49.00 ng/μL,and A260/A280ratio was 1.8. The milk was more suitable as the solvent for LAB powder compared to distilled water,and when the sampling quantity of LAB powder was 0.5 g/mL,the DNA concentration was 81.00 ng/μL. The best incubation time of lysozyme was 1 h,and the expanded incubation time had no significant improvement for cell lysis. The extracted DNA concentrations from five kits were all over 20 ng/μL,and the A260/A280ratio was greater than or close to 1.8. Among the five kits,the one from Tiangen had the best DNA concentration and purity. It was proved that the established pretreatment method can effectively remove fats,proteins and polysaccharides. Each of the five kits can be used to extract DNA from yogurt and LAB powder,however,the choice should be made based on different experiment requests.

yogurt;lactic acid bacteria powder;sample pretreatment;DNA extraction;comparison;PCR

2015-07-15

肖其胜(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全，E-mail：xiaoqsheng@163.com。

何宇平(1964-)，男，本科，研究员，研究方向：食品卫生与检验，E-mail：heyuping@shciq.gov.cn。

丁卓平(1957-)，女，本科，教授，从事食品保健与安全的教学和研究工作，E-mail：zpding@shou.edu.cn。

上海市科委长三角联合科技攻关项目(14495810200)；国家质检总局项目(2015IK227)。

TS252.54

A

1002-0306(2016)03-0307-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.056