姜油树脂中β倍半水芹烯的分离纯化

周长远,王　艳,杜爱玲

(1.枣庄市台儿庄区林业局,山东枣庄 277400;2.山东职业学院生物工程系,山东济南 250104;3.山东大学化学与化工学院,山东济南 250061)



周长远1,王艳2,杜爱玲3,*

(1.枣庄市台儿庄区林业局,山东枣庄 277400;2.山东职业学院生物工程系,山东济南 250104;3.山东大学化学与化工学院,山东济南 250061)

应用超临界二氧化碳萃取姜油树脂,选用乙醇-水作流动相,HPD-100大孔树脂作固定相分离出其中的烯类物质,并用高效液相色谱法进行跟踪检测确定含烯类的洗脱段。对比不同展开剂下烯类物质在硝酸银硅胶板上的层析效果,最终选用V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的溶剂作流动相分离其中的β-倍半水芹烯。GC/MS检测结果表明,分别选用HPD-100大孔树脂和硝酸银硅胶作为固定相可以将姜油树脂中的β-倍半水芹烯很好的分离出来,其峰面积百分数达88.73%,收率为84.05%。通过进一步HPLC检测证明β-倍半水芹烯具有紫外吸收,其特征吸收波长为232 nm。

硝酸银硅胶,β-倍半水芹烯,分离

β-倍半水芹烯与姜烯等同属倍半萜烯类化合物,均为姜油树脂的主要活性成分[1]。研究证实,其性质同姜烯相似,具有多种生物活性,如抗病毒、抗生育和抗溃疡等[2]。由于姜油树脂中倍半萜烯类化合物同分异构体较多,目前针对β-倍半水芹烯的分离纯化方法较少。贾雁高等[3]曾采用普通硅胶柱进行姜烯的分离纯化,最终所得的样品姜烯和β-倍半水芹烯也没有完全分离。Winstein等人[4]发现银离子可以与烯烃类物质发生可逆反应,形成稳定的络合物,其稳定性与双键的位置有关[5-6]。黄汉昌等人[7]曾利用银离子络合分离出了香茅次油中的β-榄香烯。

姜油树脂中不同类型倍半萜的双键位置不同,因此可以与银离子形成稳定性不同的络合物。本文根据β-倍半水芹烯的结构特点,参照普通硅胶柱的工艺流程,利用硝酸银硅胶柱从姜油树脂中分离纯化β-倍半水芹烯。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

姜油树脂南阳张仲景大厨房股份有限公司;HPD-100大孔树脂沧州宝恩吸附材料科技有限公司;柱层析硅胶200～300目、硅胶层析G板青岛海洋化工厂;乙醇、硝酸银、甲醇、乙酸乙酯、正己烷、香草醛、浓硫酸,分析纯天津市广成化学试剂有限公司。

HY-4调速多用振荡器江苏金城国胜实验仪器厂;上海沪西自动柱层析系统;TU-1901双光束紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司;气相-质谱联用仪、高效液相色谱仪(紫外检测器)美国安捷伦公司。

1.2实验方法

1.2.1HPD-100大孔树脂分离烯类段物质参照王艳等[8]有关树脂柱的操作,将已处理好的HPD-100大孔树脂采用40%的乙醇装柱,称取1 g左右姜油树脂加入层析柱中,用50%的乙醇淋洗,采用不同配比的乙醇-水体系分别进行洗脱,控制流速为1 mL/min左右,收集洗脱液,备测。

1.2.2UV和HPLC分析用紫外分光光度计跟踪检测,分别记录232、262、282 nm下的实验结果。

同时用高效液相色谱仪测定各洗脱液的组成。

检测条件:ODS柱,柱温25 ℃;二极管阵列检测器,检测波长232、262、282 nm;甲醇-水体系,梯度洗脱,流量 1 mL/min。

1.2.3硝酸银硅胶G板及硝酸银硅胶的制备将硅胶G板(含硅胶的一面向下),轻轻放到10%的硝酸银溶液中,浸泡10～20 s左右,取出,放在避光处晾干,备用[9]。

称取硝酸银于体积分数为70%的甲醇溶液中,待硝酸银溶解后加入硅胶,搅拌均匀,于110 ℃下避光烘干,备用。

1.2.4TLC分析将烯类段流出液点样于硝酸银硅胶G板一端,展开,然后用1%的香草醛浓硫酸溶液显色。

1.2.5硝酸银硅胶柱层析法分离β-倍半水芹烯避光条件下,将已处理好的硝酸银硅胶采用干法装柱[10]。取烯类段样品上样,加洗脱剂,控制流速,收集洗脱液,备测。

1.2.6HPLC和GC-MS分析用高效液相色谱仪和气相-质谱联用仪测定1.2.5中洗脱液的组成。

HPLC检测条件同1.2.2。

GC-MS检测条件参照姜烯的检测条件[3]。

1.2.7β-倍半水芹烯回收率的计算参照贾雁高等人的计算方法[3],利用分离所得β-倍半水芹烯样品和姜油树脂的GC/MS分析数据,计算β-倍半水芹烯的收率:

其中,Y为β-倍半水芹烯的收率;A1为单位体积样品中β-倍半水芹烯的峰面积计数;A2为姜油树脂单位体积样品中β-倍半水芹烯的峰面积计数;V1为β-倍半水芹烯样品的体积,mL;m为姜油树脂的上样量;N为姜油树脂的稀释倍率。

2　结果与分析

2.1HPD-100大孔树脂分离烯类段物质

对1.2.1中分离所得样品利用紫外分光光度计跟踪检测,结果初步表明:70%的乙醇水溶液可以将姜油树脂中的酚类物质洗下,90%的乙醇溶液洗脱其中的烯类物质(如图1)。

图1　HPD大孔树脂的洗脱曲线Fig. 1　Eluant curve of HPD macroporous resin

为进一步确定HPD-100大孔树脂的分离效果,对烯类段物质峰值样在232、262、282 nm下进行HPLC检测,所得色谱图如图2所示。

图2　烯类洗脱段峰值样的HPLC谱图Fig. 2　HPLC chromatograms of vinyl peak sample注:a:232 nm;b:262 nm;c:282 nm。

HPLC分析结果表明,10 min前没有姜酚的特征吸收峰(RT为2.9 min左右),仅有少量的溶剂峰存在,保留时间达12 min后出现明显的谱峰,且均为烯类物质的吸收峰;又因在262 nm下的吸收强于282 nm(酚类物质的特征吸收波长),由此我们可推断90%的乙醇水溶液可以将RT值为12 min以后的烯类物质完全洗脱下来,所得烯类样中不含姜酚类物质,烯类与酚类物质实现充分分离。

2.2烯类段物质的TLC分析

合并烯类段洗脱液,以硝酸银处理后的硅胶G板作为层析介质,采用不同配比的正己烷和乙酸乙酯作展开剂,展开样品,分析效果如图3所示。

图3　烯类段物质在硝酸银硅胶G板上的TLCFig. 3　Thin layer chromatography of vinyl sample on argentated silica gel G pre-coated Plate注：a图从左到右分别为V正己烷∶V乙酸乙酯=100∶0;90∶10;80∶20;70∶30;b图从左至右分别为V正己烷∶V乙酸乙酯=98∶2;97∶3;96∶4;95∶5;94∶6;93∶7;92∶8。

图3分析结果表明,以正己烷含量为92%～98%的正己烷-乙酸乙酯的混合溶剂作展开剂时,烯类物质的展开效果较好但是区别不大;考虑到硅胶在极性条件下较易发生溶胀,致使柱压力过大的性质[11],层析过程中适宜选用弱极性的溶剂,因此最终确定为V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的溶液体系。(经GC-MS检测证明β-倍半水芹烯的显色点为a点,Rf值为0.8左右,该点在加热显色过程中挥发)。

2.3硝酸银硅胶柱层析法分离β-倍半水芹烯

量取8 mL烯类段洗脱液上样,选用V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的溶液体系洗脱,洗脱流速为2 mL/min左右。GC-MS法分析收集的β-倍半水芹烯峰值样,所得质谱图如图4所示,样品的质谱数据为:MS m/z(rel. int.):204.1(M+,29),161.0(63),162.1(9),133.0(44),134.0(9),120.0(39),119.0(26),109.0(31),93.0(60),92.0(39),91.0(58),76.9(38),68.9(100),54.9(20),所得结果与Teris A.等人分析的β-倍半水芹烯的质谱结果[12]基本相同,由此确定该样品所含物质是β-倍半水芹烯,该峰值样的总离子流图如图5所示,其含量见表β-倍半水芹烯峰值样成分组成。

图4　β-倍半水芹烯峰值样品的质谱图Fig.4　Mass Spectrum of the β-sesquiphellandrene Sample

图5　β-倍半水芹烯峰值样品的总离子流图Fig. 5　Total ion chromatogram of β-sesquiphellandrene peak sample

2.4β-倍半水芹烯的紫外吸收

将2.3中的峰值样在不同波长条件下进行HPLC检测(DAD检测器),该峰值样仅在232 nm下出现吸收峰,如图6。分析结果表明,β-倍半水芹烯具有紫外吸收,其特征吸收波长为232 nm,在1.2.1与1.2.5的分离条件下β-倍半水芹烯的峰面积百分含量可达93.39%。

图6　β-倍半水芹烯峰值样品的HPLC谱图Fig.6　HPLC spectrums of the β-sesquiphellandrene peak sample

2.5β-倍半水芹烯收率的计算

利用表1中得到的β-倍半水芹烯峰面积计数和姜油树脂的GC/MS分析数据[13],姜油树脂中β-倍半水芹烯的AA为19138673,利用1.2.7中的计算公式计算其收率。在选定的分离条件下,共收集样品约200 mL,其中含β-倍半水芹烯样品约35 mL,最终计算其收率为84.05%。

表1　β-倍半水芹烯峰值样成分组成Table 1　Components of β-sesquiphellandrene Product

3　结论

选用HPD-100大孔树脂作固定相,90%的乙醇-水作流动相,可以分离出姜油树脂中的烯类物质,然后选用V正己烷∶V乙酸乙酯=95∶5的混合溶剂,采用硝酸银硅胶柱能较完全的分离出其中的β-倍半水芹烯,其峰面积百分数为88.73%,收率达84.05%,HPLC的分析结果证明β-倍半水芹烯在232 nm下具有紫外吸收。

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Separation ofβ-sesquiphellandrene from ginger oleoresin

ZHOU Chang-yuan1，WANG Yan2，DU Ai-ling3,*

(1.TaiEr zhuang Forestry Bureau of Zaozhuang Municipal,Zaozhuang 277400,China；2. Department of Bioengineering,Shandong Polytechnic,Ji’nan 250104,China；3. School of Chemistry and Chemical Engineering,Shandong University,Ji’nan 250061,China)

A ethanol-water solution was used as mobile phase,and the HPD-100 macroporous resin as the stationary phase to separate the vinyl part from ginger oleoresin extracted by supercritical carbon dioxide,and HPLC was used for detecting vinyls tracing. Different developing solvents of vinyls on argentated silica gel G pre-coated plate were compared,Vhexane∶Vethylacetate=95∶5 was determined as the mobile phase to sepatateβ-sesquiphellandrene. The GC/MS test results indicated that HPD-100 macroporous resin and silver nitrate modified silica gel were separately used as the stationary phase which could effectively separateβ-sesquiphellandrene from ginger oleoresin with 88.73% area percentage and 84.05% recovery. Through further HPLC analysis,β-sesquiphellandrene was found its existence of UV absorption at 232 nm.

silver nitrate modified silica gel;β-sesquiphellandrene;separation

2015-04-23

周长远(1985-),男,硕士,研究方向：种质资源创新与分子生物学研究,E-mail:fangfeiyuanfang@126.com。

杜爱玲(1956-),女,硕士,教授,研究方向：天然产物的提取分离等,E-mail:duailing56@163.com。

科技部农业科技成果转化项目(2008GB2C600178)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)03-0225-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.039