响应面法优化红树莓花色苷超声辅助提取工艺的研究

万　山,杨　喆,朱保庆,欧阳杰

(北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)



响应面法优化红树莓花色苷超声辅助提取工艺的研究

万山,杨喆,朱保庆,欧阳杰*

(北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)

以红树莓为原料,采用超声辅助法对其中的花色苷进行提取,研究了超声功率、间歇时间、提取时间和提取温度四个因素对花色苷得率的影响。在此基础上,根据中心组合实验设计原理,分析了各因素的显著性和交互作用,优化超声辅助提取参数。最终得到树莓花色苷较优提取工艺条件:超声功率900 W,间歇时间3 s,提取时间50 min,提取温度为50 ℃。此条件下树莓花色苷的提取得率为0.163 mg/g。

红树莓,花色苷,超声辅助提取,响应面

红树莓(Rubuslambertianus)属于蔷薇科悬钩子属灌木、半灌木或匍匐草本植物,主要生长在北半球温带地区。我国目前27个省区有树莓栽培,其中在西南地区分布最为集中[1]。树莓含有低卡路里、高纤维和多种生物活性物质,如黄酮类、酚酸类、木脂素类和鞣酸类物质。在酚类化合物中,鞣花单宁和花色苷是树莓显色和促进人体健康的有效物质,它们具有抗氧化性、抗癌、舒张血管和抗菌等特性[2-3]。研究表明,红树莓含有11种花色苷,其中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-槐糖苷含量较高,不同品种树莓花色苷差异很大,与生长环境、采收时间、成熟度等有较大关系[4]。

目前,超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、微波辅助提取法和溶剂萃取法等方法已经被应用于多种生物活性物质的提取,其中超声波辅助提取法因仪器便宜、操作简单、能有效代替传统提取工艺等优势得到广泛应用,它是利用超声波使溶剂产生声空化效应,加速有效成分溶解,缩短提取时间,进而提高有效成分的产量,同时还能避免高温对提取物的影响[5-7]。Kashif Ghafoor[5]利用超声波辅助法从葡萄籽中提取出花色苷,其提取得率为2.29 mg/mL。李金星[6]以蓝莓果渣为原料,研究超声辅助提取工艺条件,每克蓝莓果渣能提取出花色苷(9.91±0.05)mg,与浸提法相比,超声辅助提取时间较短,提取量大。李双石[7]研究表明超声波辅助提取葡萄皮渣花色苷,不仅可以显著提高花色苷的提取量,还可以增加花色苷的提取类型。目前对树莓花色苷溶剂萃取、稳定性研究较多,而对超声辅助提取树莓花色苷参数优化研究较少。本研究对树莓中的花色苷进行超声波辅助提取,并通过响应面分析法优化提取条件,得出最优参数,为树莓的综合利用提供研究基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

红树莓河南信阳鸡公山国家森林公园,采后存放于-20 ℃冰箱中。无水乙醇、盐酸等分析纯,北京化学试剂公司。CTXNW-2B超声循环提取机北京弘祥隆生物技术股份有限公司,T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器责任有限公司。

1.2实验方法

1.2.1提取工艺红树莓→解冻→研磨→超声提取→抽滤→树莓花色苷提取物

称取10 g红树莓,室温下解冻后研磨,按照料液比1∶20加入到200 mL的提取溶剂中,设定不同的超声辅助提取参数进行提取,然后将提取液抽滤,滤液即为红树莓花色苷提取物。

1.2.2最大吸收波长的测定取一定量鲜果,解冻后研磨,提取溶剂为体积分数为1%的盐酸水溶液,按照料液比1∶20于50 ℃浸提1 h,然后抽滤取滤液,在190～800 nm处进行全波长扫描,确定树莓花色苷提取液的最大吸收波长。

1.2.3提取溶剂的选择经参考大量文献,分别选取不同溶度盐酸水溶液、不同体积分数乙醇溶液及不同体积分数盐酸酸化乙醇溶液为提取剂,在一定条件下进行提取实验,以树莓花色苷提取得率为指标,确定最佳提取溶剂。取一定量鲜果,解冻后研磨,提取溶剂分别为:体积分数为0、1%、2%、3%、4%的盐酸水溶液,体积分数为0、20%、40%、60%、80%的乙醇水溶液,以及体积分数为0、20%、40%、60%、80%的盐酸酸化乙醇溶液(pH3),按液料比1∶20于50 ℃浸提1 h,然后抽滤取滤液,在506 nm处测吸光度值,计算花色苷含量,重复三次,确定最佳提取溶剂。

1.2.4花色苷含量的测定方法参考pH示差法稍作改动[2,8]。取1.0 mL红树莓花色苷提取液,分别用盐酸-氯化钠缓冲液(pH1.0)和醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5),稀释至10 mL,室温下放置15 min,在506和700 nm处测吸光度值,按以下公式计算花色苷含量:

其中:X为花色苷含量(mg/g),ΔA=(A506 nm,pH=1.0-A700 nm,pH=1.0)-(A506 nm,pH=4.5-A700 nm,pH=4.5);V为稀释体积/mL;n为稀释倍数;M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量(449 g/mol);ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数[26900 L/(mol·cm)];m为树莓质量/g;L为比色皿厚度(1 cm)。

1.2.5单因素实验设计以超声功率、间歇时间、提取时间、提取温度四个因素为研究对象,以提取液中花色苷含量为指标,进行单因素实验。其中间歇时间是指超声仪休息时间,提取时间为超声仪间歇时间和工作时间总和。选取间歇时间为3 s,提取时间为50 min,提取温度为50 ℃,研究不同超声功率对花色苷含量的影响;选取超声功率为900 W,提取时间为50 min,提取温度为50 ℃,研究不同间歇时间对花色苷含量的影响;选取超声功率为900 W,间歇时间为3 s,提取温度为50 ℃,研究不同提取时间对花色苷含量的影响;选取超声功率为900 W,间歇时间为3 s,提取时间为50 min,研究不同提取温度对花色苷含量的影响。各因素水平见表1。

表1　单因素水平设计表Table 1　Horizontal design of single factor

1.2.6响应面实验设计在单因素实验的基础上,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理,运用Design Expert 7.0软件设计响应面实验,设计树莓花色苷提取响应面实验因素与水平表,进行了29组响应面实验,每组实验重复三次,确定最佳实验条件[5,9]。实验因素及水平见表2。

表2　树莓花色苷提取响应面实验因素与水平Table 2　Factors and levels of response surface methodology

2　结果与分析

2.1最大吸收波长测定

由图1可知,树莓花色苷可见光区的最大吸收波长在506 nm处,实验中测定树莓花色苷含量均采用此波长,与肖军霞等研究的510 nm略有差异[8,10],可能是因为红树莓的品种不同导致的。

图1　红树莓花色苷全扫描图谱Fig.1　The full scanning spectrum of red raspberry anthocyanin

2.2提取溶剂的选择

花色苷属于水溶性多酚类化合物,可溶于水、乙醇等极性溶剂中,在酸性条件下稳定[6]。由图2可知,树莓花色苷在盐酸水溶液中提取效果最好,当盐酸浓度为1%时,提取液中花色苷含量为0.158 mg/g,显著(p<0.05)高于20%酸化乙醇的0.147 mg/g。而乙醇溶液的提取效果比水更差些,这是因为水的极性比乙醇强,而酸溶液的极性更强,因此本实验选用体积分数为1%的盐酸水溶液作为提取溶剂。

图2　不同提取溶剂对树莓花色苷提取含量的影响Fig.2　Effects of solvents on the extraction yield of raspberry anthocyanins

2.3单因素实验结果

超声功率、间歇时间、提取时间和温度对树莓花色苷含量的影响如图3。结果表明,随着超声功率的增大空化效应增强,树莓细胞壁破裂速度加快,花色苷不断溶出[2],当超声功率达到900 W时,树莓提取液中的花色苷含量最高,达到0.161 mg/g,显著(p<0.01)高于600～800 W时的花色苷含量。之后随着超声功率的升高,花色苷含量不断下降,这可能是由于超声功率过大破坏了花色苷的稳定[11],因此,选择最佳超声功率为900 W。当总时间一定时,间歇时间越长,表示工作时间越短,间歇时间低于3 s时,花色苷含量随间歇时间的增加而增加,3 s时含量达到最高,超过3 s后略有降低,可能是因为间歇时间过长,树莓花色苷提取不够充分,从而使含量下降[12],因此选择最佳间歇时间为3 s。

随着提取时间的增加,树莓花色苷含量不断上升,当提取时间达到50 min时含量达到最大,继续增大提取时间可能会使花色苷分解[13],因此实际操作中的最佳提取时间为50 min。随着温度的上升,树莓花色苷含量不断提高,当温度达到50 ℃时含量达到最高,继续升高温度含量略有下降,可能是由于过高的温度会对花色苷的结构造成破坏[11,14-15],因此,选择最佳提取温度为50 ℃。

图3　不同参数对树莓花色苷提取含量的影响 Fig.3　Effects of different parameters on the yield of raspberry anthocyanins

表3　响应面设计方案及结果Table 3　Desiging scheme and results of response surface methodology

表4　回归方程的方差分析表Table 4　Variance analysis of regression equation by response surface

注:*代表0.05显著水平;**代表0.01显著水平。

2.4响应面法实验结果

2.4.1树莓花色苷超声辅助提取工艺回归模型的建立及方差分析根据单因素实验结果,以超声功率(A)、间歇时间(B)、提取时间(C)、提取温度(D)为自变量,以树莓花色苷含量(Y)为响应值设计响应面实验[16-18],结果如表3所示。

根据软件结果,树莓花色苷含量的回归方程如下:

Y=0.16-2.000A+1.750B+9.167C+3.000D-2.500AB-3.250AC-6.000AD+3.750BC-4.250BD-2.750CD-0.024A2-4.500B2-0.032C2-0.011D2

其中Y为树莓花色苷含量的预测值,A、B、C、D分别为以上四个自变量的值。对上述方程进行方差分析,结果如表4所示。

2.4.2响应面分析根据回归方程,各因素间交互作用的三维曲面见图4～图9。三维曲面反映每两个影响因素之间的交互作用,等高线形状越趋向于椭圆形交互作用越显著[2,18-19],由图可以看出,四个因素的交互作用均不显著。

图4　Y=f(A,B)的响应面Fig.4　Responsive surface graph of Y=f(A,B)

图5　Y=f(A,C)的响应面Fig.5　Responsive surface graph of Y=f(A,C)

图6　Y=f(A,D)的响应面Fig.6　Responsive surface graph of Y=f(A,D)

图7　Y=f(B,C)的响应面Fig.7　Responsive surface graph of Y=f(B,C)

图8　Y=f(B,D)的响应面Fig.8　Responsive surface graph of Y=f(B,D)

图9　Y=f(C,D)的响应面Fig.9　Responsive surface graph of Y=f(C,D)

2.4.3最佳超声波辅助提取工艺条件的确定为进一步确定最佳提取条件,利用Design Expert 7.0软件对提取的工艺条件进行优化,提取较优工艺参数为:超声功率为894.15 W,间歇时间3.15 s,提取时间50.21 min,提取温度为51.23 ℃,此条件下,树莓花色苷含量的预测值为0.162 mg/g。为方便实际操作,将提取工艺参数调整为:超声功率900 W,间歇时间3 s,提取时间50 min,提取温度50 ℃,在此条件下进行三次平行实验,实际测得树莓花色苷的平均提取得率为0.163 mg/g,接近软件分析得到的预测值,说明实验模型可行度高,与实际情况拟合度好。

3　结论

本实验采用超声波辅助提取法,选取了超声功率、间歇时间、提取时间、提取温度4个因素,研究其对树莓花色苷产量的影响,通过响应面设计原理建立了提取工艺的回归方程模型,经方差分析该模型拟合度良好。得到最佳提取工艺参数为:超声功率为894.15 W,间歇时间3.15 s,提取时间50.21 min,提取温度为51.23 ℃,实际实验参数为功率900 W，间歇时间3 s,提取50 min，温度50 ℃,树莓花色苷预测值为0.162 mg/g,调整参数后经实验得出实际值为0.163 mg/g,接近预测值。

[1]王小蓉,汤浩茹,邓群仙. 中国树莓属植物多样性及品种选育研究进展[J]. 园艺学报,2006,33(1):190-196.

[2]Amir Golmohamadi,Gregory Möller,Joseph Powers,et al. Effect of ultrasound frequency on antioxidant activity,total phenolic and anthocyanin content of red raspberry puree[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2013,20:1316-1323.

[3]Ramunè Bobinaité,Pranas Viškelis,Petras Rimantas Venskutonis. Variation of total phenolics,anthocyanins,ellagic acid and radical scavenging capacity in various raspberry(Rubus spp.)cultivars[J]. Food Chemistry,2012,132:1495-1501.

[4]William Mullen,Michael E J Lean,Alan Crozier. Rapid characterization of anthocyanins in red raspberry fruit by high-performance liquid chromatography coupled to single quadrupole mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A,2002,966:63-70.

[5]Kashif Ghafoor,Yong Hee Choi,Ju Yeong Jeon,et al. Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds,antioxidants,and anthocyanins from grape(Vitis vinifera)seeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57:4988-4994.

[6]李金星,胡志和,马立志,等. 超声波辅助提取蓝莓果渣中花色苷的条件研究[J]. 食品工业科技,2013,34(20):255-259.

[7]李双石,李浡,张虎成,等. 超声波提取条件对酿酒葡萄皮渣花色苷的影响[J]. 食品工业科技,2013,34(18):294-297.

[8]肖军霞,黄国清,仇宏伟,等. 红树莓花色苷的提取及抗氧化活性研究[J]. 食品科学,2011,32(8):15-18.

[9]李钰,吴卫,苏华,等. 响应面法优化紫苏籽粕超声辅助提取原花青素工艺[J]. 食品科学,2014,35(4):50-54.

[10]白立敏,辛秀兰,江波,等. 树莓红色素的提取及稳定性研究[J]. 食品添加剂,2007,28(12):170-195.

[11]左勇,李杨,谢晖,等. 超声波辅助提取桑椹酒糟中花青素的研究[J]. 中国食品添加剂,2012(6):115-121.

[12]熊海蓉,文祝友,蒋利华,等. 超声波辅助提取野生火棘果中红色素的研究[J]. 中国食品添加剂,2013(1):121-125.

[13]蒋利华,熊海蓉,文祝友,等. 超声波辅助提取野生火棘果中黄色素的研究[J]. 粮油食品科技,2013:21(3):68-71.

[14]杨雪飞,潘利华,罗建平,等. 蓝莓色素的超声提取工艺及稳定性[J]. 食品科技,2010,31(20):251-255.

[15]Roman Buckow,Anja Kastell,Netsanet Shiferaw Terefe,et al. Pressure and temperature effects on degradation kinetics and storage stability of total anthocyanins in blueberry juice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58:10076-10084.

[16]孙海燕. 响应面法优化草莓中花青素提取工艺参数[J]. 食品工业科技,2013,34(10):243-250.

[17]孟宪军,王成,宋德群,等. 响应面法优化超声提取蓝莓花色苷工艺的研究[J]. 食品科技,2010,35(9):249-253.

[18]杨喆,万山,张乔会,等. 响应面法优化山杏核壳总黄酮提取工艺及其抗氧化性的研究[J]. 食品工业科技,2015,36(6):279-284.

[19]Hui Teng,Won Y Lee,Yong H Choi. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of polyphenols,anthocyanins,and antioxidants from raspberry(Rubus coreanus Miq.)using response surface methodology[J]. Food Analytical Methods,2014,7:1536-1545.

Parameters optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins from red raspberry by response surface methodology

WAN Shan,YANG Zhe,ZHU Bao-qing,OUYANG Jie*

(Department of Food Science and Engineering,College of Biological Science and Technology,Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Anthocyanins were ultrasound-assisted extracted with red raspberry used as raw material. The effects of four factors including ultrasonic power,internal time,extraction time and temperature on the yield of anthocyanins were investigated. Based on above results,the significance and interaction of each factor were analyzed in accordance with Box-Behnken. Extraction parameters of anthocyanins from red raspberry were optimized by response surface methodology,which were determined as follows:ultrasonic power of 900 W,internal time of 3 s,extraction time of 50 min and extraction temperature of 50 ℃. Under the above conditions,the extraction yield of anthocyanins was 0.163 mg/g.

Red raspberry;anthocyanins;ultrasound-assisted extraction;response surface methodology

2015-06-05

万山(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物提取，E-mail:348173528@qq.com。

欧阳杰(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：农产品加工与贮藏工程，E-mail:ouyangjie@bifu.edu.cn。

中央高校基本科研业务费专项资金资助(2015ZCQ-SW-04)；第44批“留学回国人员科研启动基金”资助项目。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.038