重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化

李晓红,柳　倩,王　蓓,梅晓宏,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.北京农业职业学院,北京 102442)



重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化

李晓红1,2,柳倩1,王蓓1,梅晓宏1,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;2.北京农业职业学院,北京 102442)

在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始pH、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kwPMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条件。结果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、pH5.5、在BMMY培养基中诱导表达5 d为最佳条件。该重组蛋白kwPMEI1的表达量最高可达700.302 mg/L。

果胶甲酯酶抑制剂,毕赤酵母GS115,发酵条件,优化

天然的新鲜果蔬汁一般会呈现出均一稳定、分散良好的浑浊态。浑浊态物质在果蔬汁的颜色、风味及质地等感官品质方面起着非常重要的作用。因此,在果蔬汁的储运过程中,保持其浑浊态是很必要的。但是,随着储存时间的延长,果蔬汁易出现浑浊态消失的现象,这主要是由于果蔬汁中内源性果胶甲酯酶对果胶的脱甲酯化作用而造成的[1]。为了避免浑浊态消失,果蔬汁加工业通常用热处理的方法钝化果胶甲酯酶(PME)。但是这一过程在很大程度上会破坏果蔬汁的营养成份和感官品质。猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂的发现为解决果蔬汁浑浊态消失问题提供了一个崭新的途径。它能够与果胶甲酯酶的活性部位以非共价键的形式结合形成复合物,从而完全抑制PME的活性[2-3]。相对于热处理来说,这种方法能更好的保持果蔬汁的风味和维生素含量[4]。Casstaldo等将猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂加入橙汁中,其浑浊态在5 ℃下保持了9个月[5]。此外,经过纯化的果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)还可以用来检测果蔬汁中残余PME的活力[6-7]。但是从猕猴桃果实中直接提取PMEI非常困难,并且产量很低,难以满足果蔬汁加工业发展的需求。如果利用基因工程技术,在体外实现PMEI的大量表达,就能有效突破其提取困难、产量低的瓶颈,从而促进果蔬汁工业的快速发展。巴斯德毕赤酵母是一个高效表达系统,许多外源蛋白已在该系统中获得了成功表达。梅晓宏[8]等已将猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因转入巴斯德毕赤酵母菌KM71中成功获得了重组菌株,其重组PMEI蛋白最高表达量为0.2 g/L。该研究成果提供了果蔬汁加工业所面临的浑浊态消失问题的解决方法。毕赤酵母KM71菌株为Muts型,利用甲醇速度较慢,而毕赤酵母GS115菌株为Mut+型,利用甲醇能力强,在以甲醇为碳源时生长较快,蛋白表达量相对更高[9-10]。与KM71相比,GS115更适合于大规模工业化生产。基于以上实际情况,本论文通过构建含高拷贝kwpmei(猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因)重组菌株 GS115,研究了不同发酵培养条件对重组果胶甲酯酶抑制剂菌株表达量的影响,最终确定单因素发酵条件的最佳配方。本研究为重组果胶甲酯酶抑制剂应用到果蔬汁工业化生产中将起到积极的推进作用。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

大肠杆菌DH5a，蛋白质 Marker天根生化科技(北京)公司;重组质粒pPIC9k/PMEI本实验室构建并保存;毕赤酵母菌株GS115和KM71Invitrogen公司,于甘油中-80 ℃保存。限制性内切酶 SacⅠTaKaRa生物工程(大连)有限公司;生物素北京畅华志城科技有限公司;丙烯酰胺、双丙烯酰胺、G418Amresco公司产品,北京经科宏达生物技术有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术研究所;其他试剂国产分析纯。

HQL150C恒温摇床中国科学院武汉科学仪器研究所;LRH-150B型生化培养箱广东省医疗器械厂;超净工作台北京半导体设备一厂;高速台式冷冻离心机(型号20G)上海安亭科学仪器厂;DY24A型垂直板电泳槽、DYY-10型(ECP3000)三恒电泳仪北京六一仪器厂;WD-9405B型水平摇床北京六一仪器厂;BioDoc-It® Imager System型UVP凝胶成像仪美国UVP公司;799 GPD Titrono型自动电位滴定仪瑞士万通;UV-2102PC型紫外可见分光光度计上海尤尼柯有限公司。

1.2培养基

YPD培养基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖,若制备斜面或平板培养基则需加入2%琼脂粉;MD培养基平板:1.34% YNB、2%葡萄糖、4×10-5%生物素,2%琼脂粉;BMGY培养基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甘油;BMMY培养基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甲醇。

1.3实验方法

1.3.1毕赤酵母GS115电转化

1.3.1.1GS115感受态细胞的制备参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册[11]。

1.3.1.2GS115感受态细胞的电转化重组表达质粒pPIC9K/PMEI,经双酶切鉴定正确后,用SacⅠ进行线性化,并将其与GS115感受态细胞及0.2 cm电转化杯置于冰上,预冷10 min。在0.2 cm电转化杯内将80 μL感受态细胞和10 μg线性重组质粒立即混合均匀,冰浴5 min后,擦干电转化杯,并迅速置于电转仪上电击1次,然后立即加入1 mL冰预冷1 mol/L的无菌山梨醇溶液,混匀后,转入1.5 mL离心管中,重新置于冰上。取0.4 mL电转化物均匀涂布于MD平板上。同法以空质粒pPIC9K转化菌株GS115,作为表达的阴性对照。将His+转化子点接在新鲜MD平板上,于30 ℃进行培养直至转化子出现。

1.3.2转化子的遗传稳定性鉴定利用无菌操作技术,在细胞培养板的各孔中分别加入200 μL YPD培养基。用无菌牙签将MD平板上的His+转化子分别接入各孔中,并搅拌均匀。盖好细胞培养板的上盖,将第一批His+转化于30 ℃静置培养2 d后,取另一块新的细胞培养板,并在每孔内分别加入190 μL YPD培养基。依照次序分别向各孔内加入10 μL第一批His+转化子,并用移液器将其充分混匀。盖好细胞培养板的上盖,将第二批His+转化于30 ℃静置培养1 d。重复上两步操作,盖好细胞培养板的上盖,将第三批His+转化子于30 ℃静置培养1 d。用100 μL移液器上下反复吹吸毕赤酵母细胞培养物,使第三批His+转化子获得充分悬浮,以便于后续的高拷贝菌株的筛选。

1.3.3筛选高拷贝菌株在不同的YPD/G418平板上(G418的终浓度分别为 0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL),分别点接2 μL相同的第三批His+转化子培养物。静置30 min,待菌悬液被吸干后,将YPD/G418平板于30 ℃倒置培养,并分别在第2、3、4、5 d观察G418抗性转化子。

1.3.4 高拷贝菌株的诱导表达将用4.0 mg/mL G418筛选得到的高拷贝重组菌株于新鲜YPD平板上划线,30 ℃倒置培养48 h。挑取一单菌落接种于接种于5 mL YPD培养基中培养过夜。按1%接种量取2.5 mL菌液接种于25 mL BMGY培养基中,用250 mL三角瓶进行培养,在摇床转速为200 r/min、温度为30 ℃条件下培养至菌体密度OD600=2～6,1500～3000×g条件下离心5 min,收集菌体弃去上清液,用20 mL BMMY培养基重悬菌体细胞,摇床转速为200 r/min、30 ℃条件下诱导培养96 h。每天补加100%甲醇至终浓度为1%,诱导表达4 d后,4 ℃、15000×g离心5 min,收集上清。

1.3.5 表达产物kwPMEI1的SDS-PAGE分析取60 μL上清液和15 μL样品缓冲液充分混合。沸水浴中煮7～8 min。电泳所用浓缩胶和分离胶浓度分别为4%和15%,上样量为每孔30 μL。电泳条件:样品在浓缩胶时电压为80 V,当进入分离胶后电压调至120 V。待样品跑至凝胶底部时,将凝胶取出进行染色和脱色至出现清晰的蛋白条带,放入凝胶成像仪拍摄成像。根据条带深浅即可大致判断蛋白表达量的多少。

表1　发酵条件优化Table 1　Optimization of fermentation conditions

表2　各培养基配方Table 2　Culture medium and its components

1.3.6kwPMEI1抑制活性检测按照Giovane等人叙述的方法[12],制备番茄PME的粗提液,将其pH调至7.5;将20 mL 0.1%的果胶溶液的pH调至7.5,并使溶液温度恒定在25 ℃;取250 μL番茄粗提液以体积比为1∶1的比例与3株高拷贝菌株诱导表达的上清液混合,在25 ℃条件下作用15 min。将上述混合溶液分别加入到等量的果胶溶液中,同时将番茄PME粗提液加入到果胶溶液中作为阴性对照;应用pH自动电位滴定仪,分别测定上述溶液与果胶作用后pH的变化情况。

1.3.7 重组kwPMEI1蛋白表达量测定将发酵液在4 ℃下离心(15000×g,5 min),取其上清液稀释到合适的倍数。按照BCA蛋白浓度试剂盒测定总蛋白浓度的方法[13],用酶标仪于562 nm处测定反应液的OD值。kwPMEI1的浓度用BandScan软件结合蛋白总浓度进行计算。

1.3.8 发酵条件优化以YPD作为种子活化培养基,BMGY为生长培养基,BMMY为诱导培养基,分别观察甘油加入量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%)、甲醇(分析纯)添加量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)、甲醇与山梨醇溶液(100%,w/v)混合添加的比例、诱导培养基的初始pH及诱导时间对kwPMEI1表达量的影响(如表1),同时研究了BMGY、YPD、MGY、FBSH等不同培养基类型(如表2)对于kwPMEI1表达量的影响。

2　结果与分析

2.1高拷贝菌株的筛选

将2 μL相同的His+转化子培养物分别点接到不同的YPD/G418平板上(G418的终浓度分别为 0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL),结果如图1。研究表明,异源基因插入整合的拷贝数与转化子对G418的抗性存在一定的正相关性。一般来讲,基因拷贝数的增加可提高分泌蛋白的表达量[14]。在本实验中,通过筛选,在G418浓度为4.00 mg/mL的平板上,获得了3株含高拷贝的重组菌株(编号为1,2,3)。

图1　高拷贝菌株的筛选Fig.1　Selection of multiple copies注:按照从左到右、从上到下的顺序G418的 终浓度依次为 0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL。

2.2高拷贝菌株的诱导表达和SDS-PAGE分析

含高拷贝的重组毕赤酵母菌株经甲醇诱导表达后,通过SDS-PAGE检测其目的蛋白表达产物kwPMEI1的表达情况。结果如图2所示。由图可见,约16 ku(据蛋白Marker分子量和图距比例计算)处有一条明显的蛋白条带,与天然的猕猴桃PMEI分子量相近[3],此条带即为目的蛋白kwPMEI1;并且通过BandScan软件对目的蛋白和总蛋白灰度值进行测算发现发酵上清液中目的蛋白含量约占总蛋白的80%,杂蛋白较少,这将非常有利于目的蛋白kwPMEI1的纯化。

图2　高拷贝菌株表达产物kwPMEI1的 SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of kWPMEI1 from multiple copies注:M为蛋白质Marker;1～3分别为 1号、2号和3号高拷贝菌株的表达产物。

2.3kwPMEI1抑制活性分析

本实验中对3株含高拷贝的重组菌株(编号为1,2,3)的表达产物kwPMEI1蛋白的抑制活性进行了测定,结果如表3所示。

表3　kwPMEI1的抑制活性测定Table 3　Mensuration of the kwPMEI1 inhibition activity

分析各溶液的pH,发现三种混合液加入到果胶溶液中作用一段时间后,溶液的pH变化不大,而对照(混合液中无发酵上清液)的pH明显降低。说明1号、2号和3号菌株发酵上清液中的表达产物kwPMEI1对果胶甲酯酶具有生物抑制活性。

2.4发酵条件优化

2.4.1甘油加入量对kwPMEI1蛋白表达量的影响不同甘油加入量对kwPMEI1蛋白表达量的分析结果(图3)表明:当甘油加入量为3%时,kwPMEI1表达量最高,为660.962 mg/L。这是因为细胞密度随甘油加入量的升高而增大(具体数值未列出),一定程度下,蛋白表达量同细胞密度成正比[15]。但是,当甘油加入量从3.0%上升至4.0%时,细胞密度虽有所增加,蛋白表达量却下降至536.185 mg/L。原因是较高的甘油浓度在酵母发酵过程中会导致乙醇积累,乙醇是aox1启动子的阻遏物,因而导致蛋白表达量的降低[15]。

2.4.2甲醇添加量对kwPMEI1蛋白表达量的影响毕赤酵母GS115是Mut+型,利用甲醇速度较快。在诱导阶段,GS115利用甲醇作为唯一碳源,因此,甲醇添加量是kwPMEI1表达量的决定性因素之一。由图4可知,甲醇添加量为1.0%时,kwPMEI1表达量最高,达694.189 mg/L。当甲醇添加量高于1.0%时,kwPMEI1表达量下降,这是因为较高的甲醇浓度易造成甲醇氧化产物的积累,对酵母细胞产生毒害作用[16]。

图3　甘油加入量对kwPMEI1蛋白表达量的影响Fig.3　The influence of glycerol concentration on kwPMEI1 production

2.4.3山梨醇与甲醇添加比例对kwPMEI1蛋白表达量的影响山梨醇对aox1启动子无抑制作用,且山梨醇和甲醇混合添加,能够提供充足的碳源和能源,降低甲醇对细胞的毒害作用。Carmen Jungo[17]指出,山梨醇与甲醇混合补料会增加细胞密度,提高蛋白表达量。因此研究山梨醇与甲醇添加比例对于重组蛋白kwPMEI1表达量的影响是很有意义的。图5表明,当山梨醇溶液(100%,w/v)与甲醇以体积比为1∶1的比例添加到发酵培养基中时,kwPMEI1表达量最高,达到646.919 mg/L,比单独以甲醇作为唯一碳源补料发酵所得到的kwPMEI1蛋白量要高很多。

图5　甲醇和山梨醇添加比例 对kwPMEI1蛋白表达量的影响Fig.5　The influence of methanol and sorbitol co-feeding on kwPMEI1 production

2.4.4诱导初始pH对kwPMEI1蛋白表达量的影响毕赤酵母可以在pH为4～7的范围内生长,但是培养基的pH对kwPMEI1蛋白表达量仍然有一定的影响。图6表明,kwPMEI1表达量最高时的pH为5.5,诱导表达4 d后其表达量高达572.235 mg/L。在较低温度下,蛋白酶的活力较弱,对kwPMEI1的降解较少。但从整个的趋势来看,在此pH范围内,kwPMEI1表达量没有明显的变化,再次证明毕赤酵母对pH的适应能力是很强的。在pH越接近7.0时,蛋白含量越低,可能是由于在pH接近中性时,蛋白酶的活力增强,对目的蛋白的降解作用增大。

图6　诱导初始pH对kwPMEI1蛋白表达量的影响Fig.6　The influence of initial pH on kwPMEI1 production

将以上获得的发酵产物放于-20 ℃冰箱中保存两个月,蛋白含量明显下降。这与蛋白酶的降解作用有很大关系。所以在保存时可以采取低温保存(如-80 ℃),培养基中添加蛋白酶抑制剂,改变培养基的pH以及离心后将菌种和上清液分开保存等措施。

2.4.5诱导时间对kwPMEI1蛋白表达量的影响对毕赤酵母GS115进行连续12 d的诱导表达,每隔24 h取样0.5 mL用于测定总蛋白和kwPMEI1表达量。且每隔24 h补充甲醇至其终浓度为1%(v/v)。由图7可知,在第3～5 d时,表达量升高很快,在第5 d时,kwPMEI1表达量达到最高,为576.649 mg/L,之后由于蛋白酶的降解作用[18],蛋白含量有所下降,但是总体趋势比较平稳。

图7　诱导时间对kwPMEI1蛋白表达量的影响Fig.7　The influence of induction time on kwPMEI1 production

2.4.6不同类型的培养基对kwPMEI1蛋白表达量的影响重组菌株分别在上述培养基(如表2)中诱导表达96 h后,测得的蛋白表达量如图8所示。诱导过程按两种方式进行,第一种是菌种分别在YPD和BMGY培养基中生长12 h后,离心(7000 r/min,5 min)并转入新鲜的YPD(加入1%甲醇)和BMMY培养基中每隔24 h补加1%甲醇进行诱导表达(如图8中YPD和BMMY);第二种是菌种分别在YPD和BMGY培养基中生长12 h后,直接向原有培养基中加入1%甲醇进行诱导表达,每隔24 h补加1%甲醇(如图8中YPD*和BMMY*);MMY表示菌种在MGY中培养12 h后,离心收集菌体转入MMY进行诱导表达;FBSH表示菌种在BMGY中培养12 h后,离心收集菌体转入FBSH进行诱导表达。由图8可知,菌株在BMMY中按第一种诱导表达方式表达的kwPMEI1蛋白量最高,为676.385 mg/L;在FBSH中的kwPMEI1产量最低,为302.414 mg/L。

图8　不同培养基对kwPMEI1蛋白表达量的影响Fig.8　The influence of different induction media on kwPMEI1 production

重组蛋白kwPMEI1在最优发酵条件下进行诱导表达,即在诱导开始时添加3%甘油,以BMGY为生长培养基培养12 h,然后添加1%甲醇(分析纯)和1%山梨醇溶液(100%,w/v),以初始pH为5.5的BMMY为诱导培养基,诱导培养5 d,kwPMEI1产量达到700.302 mg/L。

3　讨论

质粒pPIC9K拥有细菌的卡那霉素抗性基因(Kan来自于Tn903),因此当该质粒存在于毕赤酵母细胞中,Kan基因可传递抗性给酵母细胞从而使其对抗生素G418产生抗性。研究表明异源基因插入整合的拷贝数与转化子对G418的抗性存在一定的正相关性,即单拷贝异源基因的整合可使转化子对约0.25 mg/mL剂量的G418产生抗性,而含多个拷贝异源基因的整合可提高转化子对G418的抗性,如含1～2个拷贝的转化子可对0.5 mg/mL剂量的G418产生抗性,而含7～12个拷贝的转化子可对4 mg/mL剂量的G418产生抗性。从一般意义上来讲,基因的拷贝数增加可提高分泌蛋白的表达量,这主要取决于目的蛋白自身的特性。本研究中,G418浓度达到4.0 mg/mL的浓度下筛选出3株重组菌株,这些菌株有可能含有高拷贝转化子。实验结果证明这3株重组菌株能够高效表达出重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂。

毕赤酵母只分泌很少的自身蛋白,加上毕赤酵母生长和发酵培养基中都只有少量的蛋白,而且质粒pPIC9K具有信号肽序列,该序列所编码的多肽可引导外源蛋白分泌到酵母细胞外的培养基中,因此分泌的外源蛋白是培养基中蛋白的主要组成成分,这给目的蛋白的分离和纯化带来很大方便。本实验的研究结果完全证明了以上观点。与酿酒酵母相比,毕赤酵母对外源蛋白的糖基化程度不是很高。本研究中,毕赤酵母表达的重组kwPMEI1与天然的PMEI蛋白分子量非常接近。

信号肽对异源蛋白的有效引导可能成为影响其产量的最主要因素。除此之外,诱导表达条件也会对外源蛋白的表达量产生很大影响。本实验通过对摇瓶诱导表达果胶甲酯酶抑制剂的各影响因素进行了分析,为后面进行大规模发酵生产打下了基础。

重组P.pastoris是一种甲醇诱导型工程菌,携带的外源基因只有在以甲醇为唯一碳源的环境里才能高效表达。甲醇代谢的第一步是:醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛,还有过氧化氢。由于醇氧化酶与O2的结合率较低,因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。细胞中大多数的醇氧化酶是aox1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导aox1基因的高水平表达代谢,也影响了外源基因的表达情况。因此,发酵过程中甲醇浓度是影响目的蛋白表达量的重要因素。pH决定营养物的解离状态,制约着微生物细胞对营养物质的吸收利用速率;而且在较低的pH下,蛋白酶的活力较低,对目的蛋白的降解力较弱。研究诱导时间对目的蛋白表达量的影响,有利于掌握收获目的蛋白的最佳时间,增强毕赤酵母对底物的利用率(节约能源)和获得较高的生产强度(缩短生产周期),从而利于工业化生产的顺利进行。同时,实验结果表明,在生长培养基中直接添加甲醇诱导表达法比将生长培养基离心后再转入BMMY培养基诱导表达法所得到的蛋白表达量略低。这可能是由于在生长培养基中直接添加甲醇诱导表达法的培养基中有残余的甘油,在一定程度上抑制了aox1的表达;同时,酵母利用甘油代谢所产生的乙醇和乙酸可能没有从培养基中除去[19],也会在一定程度上抑制重组蛋白的表达;酵母生长代谢所消耗的营养成分未得到及时补充,导致营养成分的缺乏和生长代谢环境的恶化,因而在生长培养基中直接添加甲醇诱导表达法的蛋白表达量偏低。但是,菌株按这两种方式所表达的蛋白量相差不大。而且直接加甲醇诱导表达法简化了实验步骤,降低染菌几率并节省试剂;而且以YPD为诱导培养基按第二种方式表达重组蛋白,成本比BMMY低,所以综合成本、操作步骤和产量等因素,以YPD为诱导培养基按第二种方式表达蛋白更方便实用。MGY培养基比BMGY少了生物素,蛋白表达量有所下降,但在摇瓶发酵培养中表达量下降不是很大。FBSH是无机培养基,虽然其诱导表达效果不如有机培养基,但是价格低廉,从投入和产出的角度来考虑,是高密度发酵培养的理想培养基。本实验从碳源添加量、诱导培养基的pH、诱导表达时间、不同类型培养基等方面研究了环境因素对于目的蛋白表达量的影响,并通过研究发现,BMMY是适合实验室条件获得kwPMEI1的培养基,FBSH是适合大规模生产发酵获得kwPMEI1的理想培养基。

果胶甲酯酶可催化果胶主链脱甲酯化作用,从而产生自由的羧基基团,同时释放出甲醇和氢离子,这将导致细胞壁周围环境pH的下降。由于PMEI与果胶甲酯酶之间可形成1∶1非共价型可逆的复合物[2],在pH为3.5～7.5范围能有效地抑制果胶甲酯酶的活性。将发酵培养基的上清液和果胶甲酯酶粗提液(调至pH7.5)以一定比例相互混合作用一段时间后,再将上述混合溶液加入到一定浓度的果胶溶液(调至pH7.5)中,观察溶液pH的变化。如果溶液的pH基本保持不变,则说明发酵培养基上清液中的果胶甲酯酶抑制剂对果胶甲酯酶的活性起到了一定的抑制作用,因此可以用这种方法来判断表达产物是否对果胶甲酯酶具有抑制活性。本实验结果证明表达产物kwPMEI1具有果胶甲酯酶抑制活性。果胶甲酯酶活性和果胶甲酯酶抑制剂的抑制活性以及二者结合而成的复合物的稳定性,受多种因素的影响[19]。因此,我们后续将对kwPEMI1的抑制活性特点进行研究。

4　结论

产kwPMEI1毕赤酵母工程菌GS115在摇瓶中的最佳发酵条件为:3%甘油、1%甲醇、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、pH为5.5,诱导时间为5 d,以BMGY为生长培养基,BMMY为诱导培养基。

本研究中猕猴桃的果胶甲酯酶抑制剂基因在巴斯德毕赤酵母GS115中获得了成功高效表达,在最优发酵条件下kwPMEI1蛋白最高表达量为700.302 mg/L,说明工程菌GS115产果胶甲酯酶抑制剂具有很大的潜力。同时研究结果对该抑制剂的后续高密度发酵和工业化生产有一定的指导作用。因发酵罐具有通气量充足和自动控制等优势,一般情况下表达水平会高于摇瓶,所以在发酵罐中诱导表达该抑制剂,表达量有望进一步提高。这为利用基因工程技术大量获取有生物抑制活性的果胶甲酯酶抑制剂,解决果蔬加工业面临的果蔬汁浑浊态消失的难题打下了坚实的理论基础。

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Optimization of fermentation conditions for the recombinant kiwi pectin methylesterase inhibitor

LI Xiao-hong1,2,LIU Qian1,WANG Bei1,MEI Xiao-hong1,*

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442,China)

The recombinant strains GS115 were acquired,which contained multiple copies of kiwi pectin methylesterase inhibitor gene. The effects of concentration of glycerol,the methanol-sorbitol ratio in the feed medium,initial pH,introduction time and the types of culture medium on the yield of kwPMEI1 were analyzed. The optimal conditions were finally established as follows:BMMY medium,five days fermentation with 3%(v/v)glycerol,1%(v/v)methanol,and pH5.5,at the same time,the mixed feeds of sorbitol solution(100%,w/v)and methanol(the volume ratio)was 1∶1. The highest yield of kwPMEI1 was 700.302 mg/L in the above conditions.

pectin methylesterase inhibitor;PichiapastorisGS115;fermentation conditions;optimization

2015-02-09

李晓红(1987-),女,博士研究生,研究方向:营养与食品安全,E-mail:lixiaohongXHL@163.com。

梅晓宏(1971-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物技术,E-mail:mxh@cau.edu.cn。

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(2010JS079)。

TS202.3

B

1002-0306(2016)03-0160-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.026