香蕉茎秆汁液抑制晚期糖基化终末产物活性评价

商文婷,盛占武,谷满屯,郑丽丽,艾斌凌,杨劲松

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.中国热带农业科学院海口实验站,海南海口 570102;3.海南省香蕉遗传改良重点实验室,海南海口 570102)



香蕉茎秆汁液抑制晚期糖基化终末产物活性评价

商文婷1,2,盛占武2,3,*,谷满屯1,2,郑丽丽2,3,艾斌凌2,3,杨劲松1,*

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.中国热带农业科学院海口实验站,海南海口 570102;3.海南省香蕉遗传改良重点实验室,海南海口 570102)

为研究香蕉茎秆汁液抑制晚期糖基化终末产物(AGEs)活性,选用α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制模型研究其对碳水化合物代谢关键酶的抑制作用,并采用Lineweaver-Burk双倒数法研究其动力学性质。同时对AGEs的抑制和清除ABTS+·的能力也进行了评价。结果表明,香蕉茎秆汁液对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50)为1.51 mg/mL,对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为混合型抑制。香蕉茎秆汁液对α-淀粉酶的半抑制浓度(IC50)是8.64 mg/mL,抑制类型为不可逆抑制。通过实验研究,香蕉茎秆汁液具有一定清除ABTS+·的能力,对牛血清白蛋白果糖模型AGEs也具有一定的抑制作用。香蕉茎秆汁液可抑制体外AGEs的生成。

香蕉茎秆汁液,α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶,晚期糖基化终末产物

晚期糖基化终末产物(AGEs)是在非酶糖基化反应过程中,蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖(葡萄糖、果糖、戊糖等)的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的聚合产物[1]。AGEs 分为内源性和外源性。内源性 AGEs是由生物机体内的糖类与蛋白质发生糖化反应而产生的。而外源性 AGEs是指人体从外部摄入或来源于食品的 AGEs,如烟草等[2]。内源性AGEs会增加体内氧化应激性,促进肿瘤坏死因子α、白细胞介素-22等炎症性细胞因子生成,进而诱发多种慢性疾病如糖尿病、肾病、白内障、动脉粥样硬化、心脑血管疾病、阿茨海默尔病、类风湿性关节炎等[3]。外源性的AGEs通过饮食、生活多种途径能够在体内快速聚积,机体就会出现病理变化[4-5]。阻断非酶糖基化反应是抑制AGEs生成的有效途径。在美拉德反应、葡萄糖氧化、脂质过氧化和多元醇途径中,具有抗氧化、清除活性羰基、抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的物质可阻断非酶糖基化反应,进而达到抑制AGEs生成的目的[6]。

香蕉不仅是一种富含碳水化合物、维生素和矿物质的营养水果而且它的花、茎秆以及叶子也含许多次级代谢物[7]。在印度,香蕉还被用于治疗胃溃疡、高血压、腹泻、痢疾和糖尿病等[8]。有文献已经证明某些植物的茎、果实、根和花具有治疗糖尿病的作用[9]。在传统的使用中,香蕉提取物被用作衣物或纤维的媒染剂或一种可以将动物的皮毛转变成皮革的试剂[10]。近几年,香蕉茎秆汁液也开始被人们关注,有文献证实香蕉茎秆汁液提取物有止血和促进伤口愈合的功效,也被作为抗菌和抗炎的药物[11-12]。通过LC-MS检测到香蕉茎秆汁液中也含有多酚和黄酮类物质,所以由此可以判断香蕉茎秆汁液提取物可以作为抑制AGEs的天然抑制剂[13]。本文通过研究香蕉茎秆汁液对α-葡萄糖苷酶,α-淀粉酶和牛血清白蛋白-果糖模型的抑制作用、动力学特征及其抗氧化活性,旨在阐明香蕉茎秆汁液对体外AGEs生成的影响,为香蕉茎秆汁液的开发利用奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

α-葡萄糖苷酶(>100 U/mg)Sigma公司;4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)Sigma公司;碳酸钠生工生物工程(上海)有限公司;磷酸氢二钾;磷酸二氢钾;α-淀粉酶(500-1500 U/mg)Sigma;马铃薯可溶性淀粉广州化学试剂厂;3,5-二硝基水杨酸(DNS)国药集团化学试剂有限公司;酒石酸钾钠;二甲基亚砜(DMSO)中科瑞泰(北京)生物科技有限公司;磷酸氢二钠;磷酸二氢钠;丙三醇;牛血清白蛋白;果糖;叠氮化钠Sigma公司;ABTS、过硫酸钾、没食子酸、NaCl、抗坏血酸、柠檬酸、Na2S2O5、EDTA、乙醇。

CU-420型电热恒温水浴锅上海齐欣科学仪器有限公司;Multlskan FC 酶标仪赛默飞世尔(上海)仪器有限公司;S20K型pH计梅特勒托利多;UV-1800紫外可见分光光度计(日本岛津);PL303型电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司;RF-5301PC荧光分光光度计日本岛津公司;SPX-250B-Z生化恒温培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;0.22 μm水系针筒过滤器上海亚兴试剂公司。

1.2实验方法

1.2.1香蕉茎秆汁液乙醇提取物的制备在压榨出的香蕉茎秆汁液中加入100 mmol/L的NaCl,0.2 mmol/L的抗坏血酸,40 mmol/L的柠檬酸,0.1 mmol/L的Na2S2O5,以及0.2 mmol/L的EDTA-2Na,加入80%的乙醇,体积比为1∶1。然后将香蕉茎秆汁液80 ℃加热30 min,在25 ℃,10000 r/min条件下离心分离15 min。收集上清液后,旋转蒸发后得到香蕉茎秆汁液的乙醇提取物,放在4 ℃条件下备用[13]。

1.2.2香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制实验及动力学

1.2.2.1α-葡萄糖苷酶的抑制实验向试管中依次加入0.5 mL浓度为0.1 mmol/L pH6.8的磷酸盐缓冲溶液,0.1 mL 10 mg/L的α-葡萄糖苷酶酶液(酶活力 1 U/mL),0.5 mL不同浓度的样液,混匀,37 ℃恒温水浴15 min后,再加入0.5 mL浓度为2.5 mmol/L的PNPG溶液,混匀后37 ℃恒温水浴15 min,最后加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3终止反应,于405 nm处测吸光值,重复3次,取平均值[14]。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率计算公式如下:

式中:A空白:不加待测样品反应后的吸光值；A样品:加入待测样品反应后的吸光值；A背景:只加待测样品反应后的吸光值。

α-葡萄糖苷酶的IC50即半抑制浓度,计算需要测定5个点然后通过曲线拟合得到函数关系式,根据函数关系式计算得出。

1.2.2.2α-葡萄糖苷酶抑制动力学实验依次向试管中加入0.5 mL浓度为0.1 mmol/L pH6.8的磷酸盐缓冲溶液,0.1 mL 10 mg/L的α-葡萄糖苷酶酶液,0.5 mL样液,混匀,37 ℃恒温水浴15 min后,再加入0.5 mL浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L的PNPG溶液,同样混匀后37 ℃恒温水浴15 min,最后加入1 mL 0.2 mol/L Na2CO3终止反应,于405 nm处测吸光值,重复3次,取平均值。然后根据Lineweaver-Burk绘图法,确定化合物的抑制类型和Km值,最后确定香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。

1.2.3香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制实验及动力学

1.2.3.1α-淀粉酶的抑制实验分别将0.1 mLα-淀粉酶溶液(酶活力5～15 U/mL)和0.5 mL样品溶液加到试管中,摇匀,37 ℃恒温水浴15 min,继续添加0.5 mL 1%淀粉溶液,37 ℃恒温水浴10 min,取出后再加入0.5 mL DNS溶液,置于沸水中反应15 min,立即用冰水冷却(终止反应)。蒸馏水稀释至25 mL,在540 nm下测定OD值,重复3次,取平均值[15]。

α-淀粉酶活性抑制率计算公式如下:

式中:A样品:加入抑制剂和α-淀粉酶后的吸光值；A样空:加入抑制剂但不加α-淀粉酶的吸光值；A对照:不加抑制剂但加α-淀粉酶的吸光值；A对空:不加抑制剂也不加α-淀粉酶的吸光值。

α-淀粉酶的IC50即半抑制浓度的计算同α-葡萄糖苷酶的IC50的计算。

1.2.3.2α-淀粉酶抑制动力学实验参照文献[15]方法确定最适酶量和初始反应时间后,按照底物浓度对酶作用的影响规律,在一系列不同底物浓度下测定反应初始速率,再通过双倒数作图法可求出Km和Vmax。然后要判断香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制类型(可逆或者不可逆),在固定抑制剂浓度的条件下,以一系列不同浓度的酶进行反应初速率的测定,抑制剂为一组,无抑制剂为另一组,同时进行初速率测定。然后,在A540 nm,以酶浓度对反应速率作图,根据动力学图的特征分析,推断抑制剂对α-淀粉酶的抑制类型属于可逆或不可逆抑制类型。如果抑制剂对α-淀粉酶的抑制类型属于可逆抑制类型,再判断抑制剂对α-淀粉酶的抑制属于竞争、反竞争或者是非竞争抑制。

1.2.4香蕉茎秆汁液乙醇提取物的抗氧化性用10 mmol/L pH7.4的PBS配制2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液,然后用已配好的过硫酸钾溶液配制7 mmol/L的ABTS溶液,将其避光放置12～16 h后备用。ABTS储备液用10 mmol/L pH7.4的PBS稀释,使其在734 nm条件下吸光值在0.700±0.020范围内,备用。取4 mL稀释好的ABTS溶液和40 μL不同浓度的样品溶液,反应10 min后在734 nm条件下测其吸光值。以没食子酸作为标准[16]。

(对照组和空白组分别用PBS代替ABTS溶液和样品溶液)

EC50的计算同样需要测定5个浓度的清除率然后通过曲线拟合得到函数关系式,根据函数关系式计算得出。

1.2.5香蕉茎秆汁液乙醇提取物在牛血清白蛋白-果糖反应体系下对AGEs抑制作用60 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)和果糖(1.5 mol/L)分别用0.2 mol/L的PBS缓冲溶液制备(质量浓度为0.06%叠氮化物,pH7.4)。分别添加200 μL BSA和200 μL果糖溶液于试管中。实验组加入200 μL香蕉茎秆乙醇提取物、空白组添加去离子水于1.5 mL的试管中充分混匀于37 ℃培养24 h后,用0.22 μm滤膜除菌,置于-20 ℃冷藏备用[17]。培育结束后取反应液,利用荧光分光光度法(激发波长360 nm,发射波长460 nm),然后计算香蕉茎秆乙醇提取物对AGEs的抑制率:

抑制率(%)=(1-实验组的荧光强度/空白组的荧光强度)×100

1.3数据统计分析

用Excel 2007进行数据的处理及图表的绘制。

2　结果与分析

2.1香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制实验及动力学

2.1.1α-葡萄糖苷酶的抑制实验由图1所示,香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着其浓度的增加而增加,在2.0 mg/mL以下浓度和抑制率存在线性关系。香蕉茎秆汁液对α-葡萄糖苷酶的IC50为1.51 mg/mL,由此可以看出香蕉茎秆汁液乙醇提取物的抑制活性虽然低于阿卡波糖,但对α-葡萄糖苷酶也具有一定的抑制作用。而香蕉花乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶却具有较强的抑制活性,粗提物抑制率达88.56%(IC50=343.09 μg/mL),抑制率高于阳性对照阿卡波糖[18]。Pothavorn等[13]对香蕉茎秆汁液的组成进行了分析,结果表明香蕉茎秆汁液中含有大量的多酚和芳香氨基类物质，而多酚类物质大多可溶解于乙醇。因此,香蕉茎秆汁液抑制α-葡萄糖苷酶的活性可能与其含有的多酚类物质有关[13]。

桑叶是临床上常用的具有降血糖的中药之一,唐明敏[19]等研究了桑叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,其中桑叶水提物的活性最高(IC50=0.08 mg/mL),乙醇提取物的半抑制浓度IC50=0.12 mg/mL,均高于阳性对照阿卡波糖(IC50=999.31 μg/mL),由此可以看出香蕉茎秆汁液对α-葡萄糖苷酶虽具有一定的抑制作用,但抑制活性低于目前临床上常用药物。

图1　香蕉茎秆汁液乙醇提取物 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of ethanol extracts of banana stalk sap on α-glucosidase activity

2.1.2α-葡萄糖苷酶抑制动力学实验可逆性抑制有三种类型竞争型抑制、非竞争型抑制和反竞争型抑制。抑制类型不同说明酶、底物和抑制剂的结合方式不同。在竞争型抑制中,抑制剂与酶的活性部位结合后,底物就不能再与酶结合;非竞争抑制是底物与酶的活性位点结合后,也可以与抑制剂结合;反竞争型抑制是抑制剂只与酶和底物的复合物结合,而不与游离酶结合。如图2所示,抑制剂浓度选择0、1.5、2.5 mg/mL,以1/[S]为横坐标,1/v为纵坐标的Lineweaver-Burk曲线相交于第一象限,并且随着抑制剂浓度的增大,v也在增大,所以该抑制类型属于混合型抑制,底物、酶和抑制剂的结合方式不是单一的一种。张红城[20]等研究蜂胶乙醇提取物,得出其对α-葡萄糖苷酶的抑制类型属于非竞争抑制类型,说明底物和抑制剂没有竞争关系。

图2　香蕉茎秆汁液乙醇提取物抑制 α-葡萄糖苷酶活性Lineweaver-Burk曲线Fig.2　Lineweaver-Burk plot analysis of the inhibition kinetics of α-glucosidase by ethanol extracts of banana stalk sap

2.2香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制实验及动力学

2.2.1α-淀粉酶的抑制实验香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制作用如图3所示,从图中可以看出,随着抑制剂浓度的增大抑制率也在增大;抑制剂浓度为7 mg/mL时,抑制率为18.37%,而当抑制剂浓度为11 mg/mL时,抑制率达到了94.2%。经计算得出,香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的IC50为8.64 mg/mL。说明香蕉茎秆汁液的乙醇提取物对α-淀粉酶有一定的抑制作用。莫丽春[21]等研究了苦瓜、绞股蓝、山药、蜂胶提取物4种天然产物对α-淀粉酶的抑制作用,结果表明山药对α-淀粉酶无明显抑制作用,其余3种天然产物对α-淀粉酶均有抑制作用,对α-淀粉酶半抑制浓度(IC50)分别为30.6、40.7、36.1 mg/mL,对α-淀粉酶的抑制活性均低于香蕉茎秆汁液。

图3　香蕉茎秆汁液乙醇提取物 对α-淀粉酶的抑制作用Fig.3　Inhibitory effect of ethanol extracts of banana stalk sap on α-amylase activity

2.2.2α-淀粉酶抑制动力学实验香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制动力学曲线如图4所示。由于不同的酶与抑制剂的结合方式和特点不同,抑制类型有可逆抑制和不可逆抑制两种。当反应体系中有可逆性抑制剂存在时,其速率直线通过原点,反之则不通过原点。由此判定香蕉茎秆汁液乙醇提取物对α-淀粉酶的抑制类型为不可逆性抑制,抑制剂与酶结合后不能通过物理方法除去抑制剂,以至使酶失活。张丽娜[22]等研究了水翁花不同提取物对α-淀粉酶的抑制类型,得出所有提取物对α-淀粉酶的抑制类型都属于竞争型抑制,说明提取物与底物竞争α-淀粉酶的活性位点。

图4　香蕉茎秆汁液乙醇提取物 对α-淀粉酶抑制动力学曲线Fig.4　Inhibition kinetics of α-amylase by ethanol extracts of banana stalk sap

2.3香蕉茎秆汁液乙醇提取物对ABTS+·清除能力的测定

没食子酸和香蕉茎秆汁液对ABTS+·的清除率如图5所示。清除率与抗氧化剂质量浓度的线性关系是:香蕉茎秆乙醇提取物为y=0.0416x-0.0018,R2=0.9984;没食子酸为y=1240.1x+1.008,R2=0.9975;而香蕉花各部分的抗氧化活性却很高,如花、生长点和苞片的 EC50分别为:4.16、2.21、2.08 μg/mL[23]。张丹等[24]研究了槟榔提取物对ABTS+·的清除能力,研究表明槟榔的乙酸乙酯和正丁醇提取物清除ABTS+·的能力都很高,其EC50分别为2.04和7.62 μg/mL。

图5　没食子酸(a)和香蕉茎秆汁液乙醇提取物(b) 对ABTS+·清除能力Fig.5　ABTS+· radical scavenging capacities of the gallic acid(a)and ethanol extracts of banana stalk sap(b)

2.4香蕉茎秆汁液乙醇提取物在牛血清白蛋白-果糖反应体系下对AGEs抑制作用

香蕉茎秆汁液乙醇提取物对荧光AGEs的抑制结果如图6所示。从图中可以看出,当抑制剂的浓度是2 mg/mL时,抑制率是17.97%;而阳性对照氨基胍在浓度为1.5 mg/mL时的抑制率是63.96%(本实验室之前的实验结果)。由此可以看出,香蕉茎秆汁液对AGEs具有一定的抑制作用。Wang[25]等研究发现1.0 mg/mL小麦麦麸提取物在牛血清白蛋白(BSA)-果糖体系中,可以减弱糖化BSA 64%的荧光强度,对该体系产生的AGEs具有较好的抑制效果。Chompoo[26]等研究艳山姜各部分的提取物对AGEs的抑制效果,发现根茎提取物对AGEs有很好的抑制效果,其半抑制浓度低至(164±8.11) μg/mL。其他部分的提取物对AGEs也有很好的抑制作用,均高于阳性对照氨基胍。相比之下,香蕉茎秆汁液对AGEs抑制率较低,可能是由于在香蕉茎秆汁液收集的过程中,汁液中的酚类物质与空气接触很快被氧化,失去了抗氧化能力,导致对AGEs的抑制效果不好;也可能由于未对香蕉茎秆汁液乙醇提取物进行分离纯化,汁液中存在少量的蛋白质和糖,影响了其抑制活性。

图6　香蕉茎秆汁液乙醇提取物对AGEs的抑制作用Fig.6　Inhibited effect of ethanol extracts of banana flowers against AGEs

3　结论

香蕉茎秆汁液可抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性,其IC50分别为1.51 mg/mL和8.64 mg/mL、抑制类型为非竞争抑制类型和竞争型抑制。香蕉茎秆汁液对ABTS+·具有一定的清除能力。牛血清白蛋白-果糖反应模型结果表明,香蕉茎秆汁液对AGEs具有一定的抑制作用。因此,香蕉茎秆汁液可作为潜在的糖基化终末产物抑制剂。下一步将重点筛选茎秆汁液的活性组分,明确其多酚类化学组成,进而阐明其抑制AGEs的物质基础。

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Inhibition to advanced glycation end-products and activity evaluation of sap of banana stem

SHANG Wen-ting1,2,SHENG Zhan-wu2,3,*,GU Man-tun1,2,ZHENG Li-li2,3,AI Bin-ling2,3,YANG jin-song1,*

(1.College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China;2.Haikou Experimental Station,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 570102,China;3.Hainan Key Laboratory of Banana Genetic Improvement,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 570102,China)

To study the inhibition to advanced glycation end-products(AGEs)activity by sap of banana stem,the inhibition of key enzymes in carbohydrate metabolism was evaluated by usingα-glucosidase andα-amylase inhibition model. Inhibitory kinetic parameters were determined by Lineweaver-Burk plot. Meanwhile,the abilities of inhibiting AGEs and removing ABTS+· were also evaluated. The results showed that the median inhibitory concentration(IC50)of sap of banana stem onα-glucosidase was 1.51 mg/mL and the type of inhibition was mix-competitive inhibition. The median inhibitory concentration(IC50)of sap of banana stem onα-amylase was 8.64 mg/mL and the type of inhibition was irreversible inhibition. Through experiment,sap of banana stem had a scavenging activity on removing ABTS+· also had a certain capacity of inhibiting AGEs. The sap of banana stem had a certain inhibitory activity against AGEs.

sap of banana stem;α-glucosidase;α-amylase;advanced glycation end-products

2015-06-18

商文婷(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：废弃物综合利用，E-mail：huikudeyuswt@163.com。

盛占武(1981-)，男，硕士，副研究员，研究方向：香蕉废弃物精深加工，E-mail：shengzhanwu100@163.com。

杨劲松(1966-)，女，本科，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：food868@163.com。

国家自然科学基金青年科学基金项目(31201303)；海南省社会发展项目(SF201441); 海南省应用技术研究与开发项目(ZDXM2014104)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.001