甘肃黄芪和红芪总黄酮含量对比测定方法探索研究

叶迎，包强，王瑞海，柏冬，薛欣，张立石，刘丽梅.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 00700；.甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050

甘肃黄芪和红芪总黄酮含量对比测定方法探索研究

叶迎1，包强2，王瑞海1，柏冬1，薛欣1，张立石1，刘丽梅1
1.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；2.甘肃省中医院药学部，甘肃 兰州 730050

目的 探索建立甘肃黄芪和红芪药材中总黄酮含量对比的测定方法。方法 以毛蕊异黄酮苷等为对照品，采用紫外分光光度法和比色法（显色剂：NaNO2-Al（NO3）3-NaOH、AlCl3、Mg（Ac）2、NaOH、磷钼酸、盐酸-镁粉），考察样品和对照品吸收曲线。结果 采用比色法，黄芪、红芪样品和对照品的最大吸收波长不一致，峰形有差别或差别较大。采用紫外法测定，毛蕊异黄酮苷在Ⅱ带260 nm处呈现特征肩峰吸收，黄芪和红芪亦在Ⅱ带呈现特征肩峰吸收，吸收波长分别为263、265 nm，吸收波长与对照品基本一致。结论 常用的显色反应不适合甘肃黄芪和红芪中总黄酮含量的对比测定；异黄酮类化合物吸收Ⅱ带作为特征吸收带，适于黄芪和红芪样品中总黄酮含量的对比研究。

黄芪；红芪；总黄酮；紫外-可见分光光度法；比色法；含量测定

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.024

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge的干燥根，始载于《神农本草经》；红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根，最早记载于《神农本草经》黄芪项下，并列为上品。二者均具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、脱毒排脓、敛疮生肌的功效［1］。黄芪和红芪为同科异属植物，传统用药时二者常混用并相互替代，以西北地区尤甚［2-3］。在历代本草文献中，黄芪项下的“赤水耆”“赤色者”即为西北地区应用历史悠久的红芪，在我国西北、西南、港澳台地区及东南亚一些地区至今仍有以红芪用作黄芪替代品的习惯，认为红芪是黄芪的优良品种［4］。《中华人民共和国药典》1977年版将红芪列为正品黄芪之一，1985年版开始将两者分开，1995年版又将红芪与膜荚黄芪、蒙古黄芪同列在黄芪项下［3，5］，而2005、2010、2015年版又将其分开。张氏等［6］采用ISSR分子标记技术对不同居群的黄芪和红芪进行相关分析表明红芪和黄芪亲缘关系较远。“黄芪和红芪不分”和“黄芪、红芪为2种中药”，以及“红芪的品质优于黄芪”这些说法的科学依据是什么？甘肃是黄芪和红芪的道地产区，我们对甘肃黄芪和红芪从化学成分表征、成分含量测定、体内成分等多方面开展对比研究。本研究探索建立进行二者总黄酮含量对比的测定方法，从总黄酮含量分析讨论该问题。

黄酮类成分为黄芪和红芪共有的有效成分，主要包括异黄酮、黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮等，其中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花素苷4种成分均为异黄酮类，且含量较高［7-8］。目前，中药总黄酮的含量测定方法主要有紫外-可见分光光度法、薄层色谱法等，前者广泛用于中药总黄酮成分的含量测定［9］。黄芪总黄酮含量测定多以芦丁为对照品，采用铝盐比色法（NaNO2-Al（NO3）3-NaOH、AlCl3）在可见区进行测定［10］，近几年出现了采用毛蕊异黄酮苷为对照品在紫外区进行测定的方法［11］。红芪总黄酮含量测定报道较少，也是采用铝盐比色方法［12］。但是我们研究发现，采用铝盐进行反应，样品在可见光区域未呈现吸收或者吸收值很弱，难以定量。鉴于黄芪和红芪所含黄酮类成分不完全相同，采用何种对照品、何种方法测定含量更适宜，本试验对此开展了探索研究，以期建立适合甘肃黄芪和红芪总黄酮含量对比的测定方法。

1 仪器与试药

BT25S型电子天平（德国，赛多利斯），8453型紫外可见分光光度仪（美国，Agilent公司），DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），RE-52A型旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司），KQ-250型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

对照品毛蕊异黄酮苷（批号111920-201304）、芒柄花素（批号111703- 200603），中国食品药品检定研究院；对照品毛蕊异黄酮（批号PS13081501）、芒柄花苷（批号PS12051101），成都普思生物科技有限公司；对照品芦丁（批号20141125），北京坛墨质检科技有限公司；黄芪、红芪饮片，甘肃省宕昌县六合中药材合作社，经中国中医科学院中药研究所胡世林教授鉴定，分别为蒙古黄芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao和多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的根；Al（NO3）3、NaNO2、AlCl3、Mg（Ac）2、磷钼酸、镁粉、甲醇、无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1对照品溶液的制备

取毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素和芦丁对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成含毛蕊异黄酮苷217 µg/mL、毛蕊异黄酮212 µg/mL、芒柄花苷231 µg/mL、芒柄花素187 µg/mL、芦丁221 µg/mL的对照品溶液，备用。

2.2供试品溶液的制备

称取黄芪和红芪粉末（过50目）各1.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密吸取70%乙醇45 mL，水浴回流3 h，趁热过滤，滤液回收乙醇至干，残渣加水10 mL溶解，用水饱和正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并正丁醇液，减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解并移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得含生药浓度为150 mg/mL的黄芪、红芪供试品溶液。

2.3总黄酮含量测定

2.3.1NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法 分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液毛蕊异黄酮苷1.5 mL、毛蕊异黄酮3.0 mL、芒柄花素苷1.0 mL、芒柄花素1.0 mL、芦丁1.0 mL和“2.2”项下黄芪和红芪供试品溶液各1.0 mL，置于25 mL容量瓶中，精密加入蒸馏水使至6 mL，然后精密加入5%NaNO21.0 mL，摇匀，放置6 min，再精密加入10%Al（NO3）31.0 mL，摇匀，放置6 min，再精密加入4%NaOH 10 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀（其中毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、芦丁浓度分别为13.02、25.44、9.24、7.48、8.84 µg/mL，黄芪、红芪原药材浓度均为6.0 mg/mL），放置15 min，以相应的试剂为空白，在200～900 nm 进行扫描［10］，结果见图 1。可见，NaNO2-Al（NO3）3-NaOH显色后，黄芪和红芪的λmax分别为398 nm和394 nm，与芦丁λmax（510 nm）及其他 4个对照品溶液吸收光谱λmax不同，且光谱峰形相差较大。

2.3.2AlCl3比色法 分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液毛蕊异黄酮苷0.25 mL、芦丁0.5 mL和“2.2”项下黄芪和红芪供试品溶液各0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，以甲醇补足至5.0 mL，摇匀，再精密加入1%AlCl3溶液4 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀（其中毛蕊异黄酮苷、芦丁浓度分别为5.43、11.05 µg/mL，黄芪、红芪原药材浓度均为7.5 mg/mL）放置15 min，以相应的试剂为空白，在波长 200～900 nm进行扫描［13］，结果见图2。可见，AlCl3显色后供试品溶液在400 nm左右未见吸收，毛蕊异黄酮苷在相应波长处也没有吸收峰出现，芦丁的λmax在369 nm，但是峰形与毛蕊异黄酮苷对照品峰形不一致。

图1　NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法吸收曲线

图2　AlCl3比色法吸收曲线

2.4总异黄酮含量测定

2.4.1NaOH比色法 分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液毛蕊异黄酮苷1.0 mL、毛蕊异黄酮1.0 mL、芒柄花苷1.0 mL、芒柄花素1.0 mL、芦丁1.5 mL，置于25 mL量瓶中，精密加入0.01 moL/L NaOH溶液20.0 mL；精密吸取“2.2”项下黄芪和红芪供试品溶液0.8 mL，置于10 mL容量瓶中。均用0.01 moL/L NaOH溶液定容至刻度，摇匀（其中毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、芦丁浓度分别为8.68、8.48、9.24、7.48、13.26 µg/mL，黄芪、红芪原药材浓度均为 12.0 mg/mL），70 ℃水浴加热15 min，冷却至室温，以相应试剂为空白，在200～900 nm波长范围内进行扫描［14］，结果见图3。可见，NaOH作用后毛蕊异黄酮苷和芦丁的λmax分别为291 nm和360 nm，黄芪和红芪的λmax分别为277 nm 和 271 nm，供试品和其他对照品峰形相差较大，λmax也不一致。

图3　NaOH比色法吸收曲线

2.4.2磷钼酸比色法 分别精密吸取“2.1”项下毛蕊异黄酮苷对照品0.5 mL、“2.2”项下黄芪和红芪供试品溶液各0.25 mL，置于25 mL容量瓶中，以70%乙醇补足至3.0 mL，摇匀，精密加入硼砂-碳酸钠缓冲液10 mL，摇匀，再精密加入磷钼酸溶液1.3 mL，摇匀，室温放置5 min，精密加入NaOH试液0.2 mL，摇匀，于65 ℃水浴加热5 min，取出，放冷至室温，精密加入70%乙醇至刻度，摇匀（其中毛蕊异黄酮苷浓度为4.34 µg/mL，黄芪、红芪供试品原药材浓度均为1.5 mg/mL），以相应的试剂为空白，在波长200～900 nm进行扫描［15］，结果见图4。可见，磷钼酸作用后毛蕊异黄酮苷λmax为313 nm，黄芪和红芪λmax分别为279 nm和280 nm，且存在较强的背景吸收干扰，对照品和样品λmax不一致。

图4　磷钼酸比色光谱

2.4.3紫外分光光度法 精密吸取“2.1”项下的对照品和“2.2”项下供试品适量，甲醇稀释后，在波长200～900 nm进行扫描，结果见图5。可见，毛蕊异黄酮苷在紫外区λmax为260 nm，毛蕊异黄酮λmax为248 nm，芒柄花苷λmax为260 nm，芒柄花素λmax为249 nm，供试品黄芪和红芪的λmax分别为263 nm和265 nm，呈肩峰吸收。毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷与供试品峰形基本一致，并且结果显示样品中毛蕊异黄酮苷的含量高于芒柄花苷。

图5　紫外吸收光谱

2.5黄酮、黄酮醇、异黄酮含量测定通用方法

2.5.1醋酸镁甲醇比色法 精密吸取“2.1”项下对照品毛蕊异黄酮苷0.25 mL、毛蕊异黄酮0.25 mL、芒柄花素苷0.25 mL、芒柄花素0.25 mL、芦丁0.5 mL，“2.2”项下红芪、黄芪供试品溶液各0.10 mL，置10 mL具塞刻度试管中，水浴挥干溶剂，精密加入1% Mg（Ac）2甲醇溶液至刻度，摇匀（其中毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、芦丁分别为5.43、5.30、5.78、4.68、11.05 µg/mL，黄芪、红芪原药材浓度均为1.5 mg/mL），放置15 min，在波长200～900 nm进行扫描［16］，结果见图6。可见，黄芪和红芪的吸收图谱未见明显吸收，各个对照品与供试品的λmax不一致，峰形相差很大。

2.5.2盐酸-镁粉比色法 精密吸取“2.1”项下对照品毛蕊异黄酮苷 0.10 mL，“2.2”项下供试品溶液经过适当稀释后黄芪和红芪样品溶液分别各取0.10 mL 和0.05 mL，置含有300 mg镁粉的具塞刻度试管中，将试管置于15～16 ℃水浴，缓慢滴加盐酸4 mL，不时振摇试管，滴毕，摇匀，再精密加入70%乙醇至体积为10 mL，摇匀，置沸水浴中60 min，取出，冰浴迅速冷却，摇匀，在波长200～900 nm进行扫描［17］，结果见图 7。可见，盐酸-镁粉作用后毛蕊异黄酮苷λmax为328 nm，黄芪和红芪的λmax分别为339 nm和341 nm，吸收波长接近，但黄芪、红芪样品的峰形和对照品不一致。

图6　Mg（Ac）2甲醇比色法吸收曲线

图7　盐酸-镁粉比色法吸收曲线

3 讨论

3.1采用比色法开展黄芪、红芪总黄酮含量对比的探讨

黄芪和红芪中所含的黄酮化合物类型主要包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮等［7］，进行含有多种类型结构的总黄酮含量的对比，除了要求2个供试品采用的显色剂、测定波长统一外，还要和对照品的测定条件一致。为此，本试验根据各种类型黄酮的化学结构特征的不同，选择多种试剂与黄芪和红芪供试品作用显色，筛选适于二者总黄酮含量测定的方法。

3.1.1金属盐类试剂 黄酮类化合物分子中一般具有3，5-酚羟基、4-羰基或3'，4'-邻二酚羟基的结构，可以和铝盐、锆盐、锶盐等离子反应，多生成有色的金属络合物，可用于定性和定量分析，常用的试剂为1%AlCl3或Al（NO3）3［18］。Al（NO3）3比色法是药典最常用的总黄酮含量测定的显色剂，在碱性条件下，其与黄酮类化合物络合形成红色螯合物，使吸收峰带Ⅱ红移，以芦丁为对照品，在510 nm左右呈现吸收［9］。AlCl3比色法与Al（NO3）3比色法类似，是在非碱性条件下络合显色，生成黄色络合物进行含量测定。本试验结果表明，Al（NO3）3与黄芪和红芪样品进行显色后，吸收峰带Ⅱ的确发生红移，与芦丁出现的吸收不同（510 nm），而是在390 nm左右出现吸收，且显色后供试品溶液不稳定，吸光度随时间延长呈降低的趋势。其原因可能是供试品中所含的黄酮类成分较少，或杂质干扰，和Al3+未能形成稳定的络合物。毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素对照品与Al3+显色反应，对照品与供试品峰形有差异或差异很大，最大吸收波长不一致。文献报道AlCl3显色反应发生在 3-羟基、4-羰基和邻二酚羟基上，只存在 5-羟基、4-羰基的黄酮类物质与 AlCl3也不发生反应［19-20］。黄芪和红芪中的黄酮成分主要为异黄酮，没有3-羟基、5-羟基的结构，其化学结构不能满足上述显色反应的要求，本试验结果与文献报道一致。

3.1.2NaOH比色法 鲍氏等［14］以染料木素为对照品，采用0.01 moL/L NaOH进行反应，在266 nm处测定海南木莲叶和枝总异黄酮含量。本试验中，对照品和供试品与NaOH作用后，吸收峰发生了红移但不明显，吸收图谱峰形不吻合，且二者最大吸收波长也有差异。

3.1.3磷钼酸比色法 吴氏等［15］在硼砂-碳酸钠缓冲液的碱性条件下，以磷钼酸为显色剂，在紫外区的268 nm处测定参芪润肺颗粒中总异黄酮。本试验采用该方法，对照品和供试品吸收图谱背景吸收强烈，吸收波长不一致。

3.1.4醋酸镁甲醇比色法 醋酸镁甲醇溶液是黄酮类成分金属盐类络合反应试剂之一［21］。参照李氏等［16］测定大黄配方颗粒中总蒽醌的含量的方法（以 1.0%醋酸镁甲醇溶液为显色剂），本试验中样品与醋酸镁甲醇溶液作用后，峰形变化不大，未见明显的吸收。

3.1.5盐酸-镁粉比色法 黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇均易在盐酸镁粉作用下被还原，生成橙色到红紫色物质，在可见光区进行含量测定。刘氏等［17］以盐酸-镁粉为显色剂，进行苦参汤有效部位总黄酮含量测定。本试验用该法测定的红芪样品中总黄酮含量为1.27%，为黄芪中总黄酮含量的 5.5倍，原因可能是红芪中含有如3-羟基-9-甲氧基香豆苯醚、3，9-二羟基香豆苯醚等香豆素类［22］成分与显色剂反应，导致其含量偏高。

3.2黄芪和红芪总黄酮含量测定方法、对照品、测定波长的确定

黄酮类化合物因为分子中存在桂皮酰基、苯甲酰基组成的共轭体系，故其甲醇溶液在200～400 nm区域存在2个主要吸收带，分别为峰带Ⅰ（300～400 nm）及峰带Ⅱ（220～280 nm），不同类型的黄酮在带Ⅰ和带Ⅱ的吸收强度不同［21，23］。异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇这3类化合物中，除有由A-苯甲酰系统引起的带Ⅱ吸收（主峰）外，因B-环均不与吡喃环上的羟基共轭（或共轭很小），故带Ⅰ很弱，常在主峰的长波方向显一肩峰［21］。

本试验结果表明，黄芪和红芪中含量占总黄酮绝大部分的4种成分（毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素苷、芒柄花素）［8］的对照品及甘肃黄芪和红芪中总黄酮的甲醇溶液紫外吸收光谱符合“在带Ⅱ的260 nm左右呈现肩峰吸收”这一规律，其中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花葡萄糖苷、芒柄花素对照品λmax分别为260、248、260、249 nm，黄芪、红芪样品λmax分别为263、265 nm，样品λmax与对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花葡萄糖苷的λmax基本一致，考虑到浓度相近的情况下毛蕊异黄酮葡萄糖苷吸光度（0.615 18）明显大于芒柄花葡萄糖苷吸光度（0.316 12），说明毛蕊异黄酮葡萄糖苷在此波长下吸收更强，故选择其为含量测定对照品。因为黄芪和红芪样品总黄酮中含有多种类型的黄酮成分，并且含有一定的杂质，所以样品最大吸收波长与对照品略有偏差。由于对照品λmax（260 nm）和样品λmax（263、265 nm）处吸光度值偏差小于0.009 AU和0.003 AU，所以确定260 nm为样品测定波长。该方法可为对比甘肃不同产地红芪和黄芪中总黄酮含量奠定基础。

3.3黄芪和红芪总黄酮含量测定前处理方法的确定

本试验中对样品提取方法（回流、超声）、纯化方法（正丁醇、乙酸乙酯萃取）、提取溶剂（70%乙醇、甲醇）、提取时间（1、2、3 h）、溶剂用量（15、25、35 mL）进行了筛选。结果显示：黄芪、红芪总黄酮含量采用回流提取优于超声提取，采用正丁醇萃取优于乙酸乙酯萃取（见表 1）；采用 70%乙醇提取略优于甲醇提取（见表2）；提取时间3 h和4 h含量相差不大，选择提取3 h（见表3）；提取溶剂用量25、35 mL含量相当，均高于15 mL，选择25 mL溶剂提取（见表4）。

表1　提取方式、纯化溶剂对总黄酮含量的影响（提取溶剂甲醇）

表2　 提取溶剂对总黄酮含量的影响

表3　不同提取时间对总黄酮含量的影响

表4　溶剂用量对总黄酮含量的影响

3.4小结

本研究对相关文献报道的总黄酮含量测定方法进行了研究，结果表明，比色法并不适用于黄芪和红芪中总黄酮含量对比的测定。近年来有采用紫外分光光度法，以芦丁或毛蕊异黄酮苷为对照品，在250～287 nm之间测定黄芪中总黄酮含量的报道［11，24-25］。本研究结果显示，与比色法相比，采用紫外分光光度法更适合于红芪和黄芪总黄酮含量的测定。

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（修回日期：2016-04-20；编辑：陈静）

Study on Determination Method of Total Flavonoids in Gansu Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys

YE Ying1， BAO Qiang2， WANG Rui-hai1， BAI Dong1， XUE Xin1， ZHANG Li-shi1，LIU Li-mei1（1. Institute of Basic Theory Research of TCM， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China； 2. Department of Pharmacy， Gansu Province Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）

Objective To study the determination method of total flavonoids in Gansu Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys. Methods Calycosin glycosides etc. was selected as reference substances， comparison on the difference of absorption curves was done by ultraviolet spectroscopy and colorimetric method （NaNO2-Al（NO3）3-NaOH， AlCl3， Mg（Ac）2， NaOH， phosphomolybdic acid， HCl-Mg power）. Results With colorimetric method， the maximum absorption wavelength of referrence and the test was inconsistent. The absorption peak shape was also different. With UV method， Calycosin glycosides in band Ⅱ （260 nm） showed a shoulder absorption. Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys also showed characteristic shoulder absorptions in band Ⅱ with absorption wavelength at 263 nm and 265 nm. So the sample absorption wavelength is basically the same as that of the control sample. Conclusion Colorimetries usually used for determination of total flavonoids are not suitable for the comparison determination of Gansu Astragali Radix and Hedysarum Polybotrys. It is suitable for determining the contents of total flavonoids in samples by UV spectrophotometry at the band Ⅱ， which is the characteristic absorption band of isoflavone compound.

Astragali Radix； Hedysarum Polybotrys； total flavonoids； ultraviolet-visible spectrophotometry；colorimetric method； determination

R284.1

A

1005-5304（2016）09-0099-07

中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目（YZ-1438）

刘丽梅，E-mail：liulimeihrb@sina.com

2016-01-04）