牛磺酸对四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压的影响

李静，杨雅娟，李常娟，冯艳邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002

牛磺酸对四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压的影响

李静，杨雅娟，李常娟，冯艳
邯郸市第一医院，河北 邯郸 056002

目的 观察牛磺酸对四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压的影响，探讨其作用机制。方法 采用四氯化碳复合法制备肝硬化门静脉高压大鼠模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和牛磺酸低、中、高剂量组，各给药组给予相应药物灌胃。治疗4周后，生化分析仪测定大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和总胆红素（TBIL）含量；ELISA测定大鼠血清肝纤4项［Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）］含量以及肝组织羟脯氨酸（HYP）水平；血流动力学法测定大鼠门静脉压（PVP）、门静脉血流量（PVF）、平均动脉压（MAP）并测定心率（HR）；硝酸还原酶法测定一氧化氮（NO）含量，化学比色法测定内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性，放射免疫法测定环鸟苷酸（cGMP），紫外-可见分光光度计测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；HE染色观察大鼠肝组织病理形态。结果 与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠血清ALT、AST和TBIL含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），CⅣ、PCⅢ、HA及HYP含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高剂量组LN含量显著降低（P＜0.05）；牛磺酸中、高剂量组大鼠PVP、PVF显著降低（P＜0.05），牛磺酸高剂量组MAP显著升高且HR显著降低（P＜0.05）；牛磺酸中、高剂量组大鼠肝组织NO含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高剂量组eNOS活性、cGMP含量显著升高（P＜0.05）；牛磺酸中、高剂量组大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性显著升高且MDA含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；牛磺酸各剂量组大鼠肝组织病变明显改善，其中牛磺酸高剂量组效果最为显著。结论 牛磺酸对肝硬化门静脉高压大鼠具有抑制作用，其机制可能与牛磺酸保肝降酶，抑制氧化应激损伤，上调eNOS表达、提高NO含量，改善肝功能有关。

牛磺酸；四氯化碳；肝硬化；门静脉高压；大鼠

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.016

肝硬化患者多伴有门静脉高压，是影响肝硬化患者预后的重要因素。牛磺酸是一种含硫β-氨基酸，是牛黄的重要成分，并且广泛存在于动物组织细胞中。现代药理研究表明，牛磺酸具有促进胆汁排泄、抗氧化、保护心血管、抑制肝组织纤维化等生物学作用［1-4］。本实验采用四氯化碳复合法制备肝硬化门静脉高压大鼠模型，观察牛磺酸对四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1动物

雄性清洁级SD大鼠96只，7周龄，体质量200～250 g，河北省实验动物中心，许可证号SCXK（冀）2008-1-003。饲养于室温22～25 ℃、相对湿度60%～70%的环境，人工光照明暗交替12 h/12 h。

1.2药物

牛磺酸，美国Sigma公司，批号140213，含量≥98%；复方鳖甲软肝片，内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，批号20140624。

1.3主要试剂与仪器

丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和总胆红素（TBIL）检测试剂盒，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；Ⅳ型胶原（CⅣ）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、层粘连蛋白（LN）、透明质酸（HA）、羟脯氨酸（HYP）、一氧化氮（NO）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、环鸟苷酸（cGMP）检测试剂盒，北京博奥森生物工程有限公司。BS380生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），紫外-可见光分光光度计（日本岛津），DNM-9602酶标仪（上海圣科仪器设备有限公司），AOWERLAD-85型八道生理记录仪（AD公司），光学显微镜（日本Olympus）。

2 实验方法

2.1造模、分组及给药

大鼠皮下注射40%四氯化碳0.3 mL/100 g，3 d注射1次，并给予高脂高胆固醇饲料喂养，15%乙醇作为饮用水，6周后病理检查证实肝硬化大鼠模型制备是否成功。选取80只成模大鼠，随机分为模型组、阳性药组和牛磺酸低、中、高剂量组，每组16只，并另取16只同龄正常大鼠作为正常组。取牛磺酸精确称量，用生理盐水配制成浓度为300 mg/mL溶液为中剂量，150、600 mg/kg牛磺酸溶液分别为低、高剂量；取复方鳖甲软肝片准确称量，用生理盐水配制成浓度为270 mg/mL的溶液。各给药组均腹腔注射相应剂量药液2 mL/kg，正常组和模型组腹腔注射等量生理盐水，每日1次，连续4周。

2.2血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素含量测定

腹腔注射乌拉坦麻醉，开腹、经腹主动脉取血，1500 r/min离心10 min，取血清，生化检测仪测定大鼠血清ALT、AST、TBIL含量。严格按试剂盒说明书进行操作。

2.3血清肝纤4项含量测定

取“2.2”项所备血清，ELISA测定大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量。严格按试剂盒说明书进行操作。

2.4肝组织羟脯氨酸水平测定

待“2.2”项取血完成后，取肝脏，剪碎后通过匀浆器进行研磨匀浆，10 000 r/min离心15min，取上清液，ELISA测定大鼠肝组织HYP水平。严格按试剂说明进行操作。

2.5大鼠门静脉压、门静脉血流量、平均动脉压和心率测定

腹腔注射乌拉坦麻醉，仰位固定，开腹并游离肝门静脉主干，连接电磁流量计以测定门静脉血流量（PVF）。门静脉主干穿刺并固定，用于测定门静脉压（PVP），右颈动脉插管用于测定平均动脉压（MAP）和心率（HR）。各指标均由八道生理记录仪测量并记录。

2.6肝组织一氧化氮、内皮型一氧化氮合酶、环鸟苷酸测定

取“2.4”项所备肝组织匀浆上清液，硝酸还原酶法测定NO含量、化学比色法测定eNOS活性，放射免疫法测定cCMP含量。严格按试剂说明进行操作。

2.7肝组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛含量测定

取“2.4”项所备肝组织匀浆上清液，紫外-可见分光光度计测定大鼠肝组织 SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2.8肝组织病理形态观察

治疗结束后，腹腔注射乌拉坦麻醉，取肝脏，置于 4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片和展片处理，HE染色镜下观察大鼠肝组织病理形态。

3 统计学方法

4 结果

4.1牛磺酸对模型大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、TBIL含量升高（P＜0.01）；与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠血清ALT、AST、TBIL含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。

表1　各组大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比较（±s）

表1　各组大鼠血清ALT、AST、TBIL含量比较（±s）

注：与正常组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

组别 　只数 　剂量/（mg/kg） 　ALT/（U/L） 　AUT/（U/L） 　TBIL/（μmol/L）正常组 　16 　　48.6± 6.7 　43.1± 9.3 　 7.5±1.8模型组 　16 　　94.3±21.8△△　90.5±16.7△△　15.0±3.6△△牛磺酸低剂量组 　16 　150 　85.2±19.6 　81.4±17.7 　14.1±4.3牛磺酸中剂量组 　16 　300 　78.7±18.2*　72.8±14.1*　11.7±3.2*牛磺酸高剂量组 　16 　600 　69.0±12.4**　65.4±12.5**　10.2±2.7*阳性药组 　16 　540 　71.5±11.7*　70.6±13.2*　12.3±2.9*

4.2牛磺酸对模型大鼠血清肝纤 4项、肝组织羟脯氨酸水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝组织HYP水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、HA含量及肝组织HYP水平降低（P＜0.05，P＜0.01），牛磺酸高剂量组大鼠血清LN含量降低（P＜0.05）。结果见表2。

表2　各组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝组织HYP水平比较（±s）

表2　各组大鼠血清CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量及肝组织HYP水平比较（±s）

组别 　只数 剂量/（mg/kg） CⅣ/（μg/L） 　PCⅢ/（μg/L） 　LN/（μg/L） 　HA/（μg/L） 　 HYP/（μg/g）正常组 　16 　　34.6±17.8 　75.2±13.6 　25.4±13.8 　24.1± 8.3 　224.3±108.1模型组 　16 　　69.2± 8.4△△　208.5±47.1△△　142.6±61.3△△　89.6±27.5△△　1275.6±340.9△△牛磺酸低剂量组 　16 　150 　60.5±14.3 　182.6±43.8 　107.1±48.2 　74.2±25.1 　1032.5±294.3牛磺酸中剂量组 　16 　300 　48.1±12.7*　140.7±35.4*　83.5±42.7 　60.8±21.7*　918.7±212.6*牛磺酸高剂量组 　16 　600 　37.9±11.0**　117.4±23.2**　65.2±30.4*　43.5±18.4*　753.1±230.4*阳性药组 　16 　540 　45.2±10.9*　158.1±37.5 　71.1±29.5*　63.4±20.9*　892.4±207.5*

4.3牛磺酸对模型大鼠门静脉压、门静脉血流量、平均动脉压和心率的影响

与正常组比较，模型组大鼠PVP、PVF、HR升高且MAP降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠PVP、PVF降低，牛磺酸高剂量组MAP升高、HR降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3　各组大鼠血清PVP、PVF、MAP和HR水平比较（±s）

表3　各组大鼠血清PVP、PVF、MAP和HR水平比较（±s）

组别 　只数 　剂量/（mg/kg） 　PVP/mm Hg 　PVF/mm Hg 　MAP/mm Hg 　HR/（次/min）正常组 　16 　　9.67±1.20 　42.6±1.5 　114.8±6.1 　283.6±31.5模型组 　16 　　16.53±1.46△△　60.4±3.8△　86.3±4.2△　345.1±37.3△△牛磺酸低剂量组 　16 　150 　15.78±2.01 　54.1±3.6 　90.6±4.9 　340.2±38.7牛磺酸中剂量组 　16 　300 　14.25±1.73*　48.7±3.1*　97.4±5.3 　321.4±34.6牛磺酸高剂量组 　16 　600 　12.19±1.54*　44.3±2.7*　104.7±4.8*　292.0±32.1*阳性药组 　16 　540 　13.95±1.68*　51.8±3.4 　95.1±4.7 　329.5±36.2

4.4牛磺酸对模型大鼠肝组织一氧化氮、内皮型一氧化氮合酶、环鸟苷酸水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织 NO、cGMP含量和eNOS活性降低（P＜0.01）；与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠肝组织NO含量升高，牛磺酸高剂量组cGMP含量和eNOS活性升高（P＜0.05）。结果见表4。

表4　各组大鼠肝组织NO、eNOS、cGMP水平比较（±s）

表4　各组大鼠肝组织NO、eNOS、cGMP水平比较（±s）

组别 　只数 　剂量/（mg/kg） 　NO/（nmol/mg） 　eNOS/（pmol/mg） 　cGMP/（nmol/mg）正常组 　16 　　405.2±78.4 　0.39±0.11 　1547.3±314.7模型组 　16 　　172.6±53.9△△　0.16±0.07△△　782.5±169.1△△牛磺酸低剂量组 　16 　150 　243.5±60.3 　0.19±0.10 　914.0±183.4牛磺酸中剂量组 　16 　300 　291.7±62.6*　0.23±0.09 　1182.3±218.6牛磺酸高剂量组 　16 　600 　334.9±71.5**　0.28±0.10*　1275.2±279.5*阳性药组 　16 　540 　286.1±58.2*　0.20±0.08 　1046.1±260.3

4.5牛磺酸对模型大鼠肝组织超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物和丙二醛水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性降低及MDA含量升高（P＜0.01）；与模型组比较，牛磺酸中、高剂量组大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性升高及MDA含量降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表5。

表5　各组大鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA水平比较（±s，U/mg）

表5　各组大鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA水平比较（±s，U/mg）

组别 　只数 　剂量/（mg/kg） 　 SOD正常组 　16 　　12.4±1.7模型组 　16 　　8.3±1.2△△牛磺酸低剂量组 　16 　150 　8.7±1.5牛磺酸中剂量组 　16 　300 　9.8±1.4*牛磺酸高剂量组 　16 　600 　10.7±1.8**阳性药组 　16 　540 　9.6±1.3*GSH-Px 　 MDA 18.1±2.6 　5.31±1.26 11.3±1.9△△　13.04±3.85△△11.7±2.4 　10.92±3.60 12.5±3.3*　8.13±3.11**13.8±2.9**　6.87±2.74**12.4±2.7 　8.65±3.07*

4.6牛磺酸对模型大鼠肝组织病理形态的影响

正常组大鼠肝组织结构未见异常；模型组大鼠肝组织呈结节状，纤维组织增生显著、纤维间隔形成，汇管区及中央静脉周围可见炎细胞浸润；牛磺酸各剂量组和阳性药组大鼠肝组织病理形态改变显著改善，并呈剂量依赖性。结果见图1。

图1　各组大鼠肝组织病理形态（HE染色，×200）

5 讨论

肝硬化是一种慢性肝病，将引发肝血管结构紊乱及血流循环紊乱，最终导致门静脉高压形成，是导致肝硬化患者死亡的重要原因。通过四氯化碳复合法诱导制备的肝硬化大鼠模型具有与人类相似的肝硬化病理生理特征，多用于肝硬化门静脉高压的药物治疗研究［5-6］。

肝纤4项（CⅣ、PCⅢ、LN、HA）是临床上用来监测肝硬化进展程度的常用指标，并且在肝硬化发生发展过程中，胶原纤维大量增生，其主要成分为胶原蛋白，而HYP主要存在于胶原蛋白中，其含量反映肝硬化程度［7］。牛磺酸是一种含硫β-氨基酸，具有抗氧化、保护心血管、抑制肝组织纤维化等多种生物学作用。本实验采用通过四氯化碳复合法制备肝硬化门静脉高压大鼠模型，研究发现牛磺酸能有效降低肝硬化门静脉高压大鼠肝组织CⅣ、PCⅢ、LN、HA含量以及HYP水平，有效降低PVP、PVF、HR并提高MAP水平，降低血清ALT、AST、TBIL的含量，改善肝组织的病理形态变化，并且上述作用均具有剂量依赖性。

体内NO是一种信号分子，能够通过激活可溶性腺苷酸环化酶、升高细胞内cCMP水平而发挥刺激血管舒张，促进血液循环的生理作用［8］，而eNOS是体内催化NO生成的生物酶。本实验结果发现，牛磺酸能有效促进肝硬化门静脉高压大鼠肝组织eNOS的表达，提高NO及cGMP的含量，提示牛磺酸能够通过调节NO信号传导通路，而表现出降低肝内血管阻力和门静脉压力的作用，且该作用具有剂量依赖性。

SOD能够通过提供氢原子配体而还原氧自由基生成H2O2［9］，并且在GSH-Px的催化作用下，能够进一步被还原生成对人体无害的H2O和O2［10］，从而消除氧化应激损伤；脂质过氧化终产物MDA的含量也能够间接反映机体氧化应激损伤程度。本研究发现，牛磺酸能有效改善肝硬化门静脉高压大鼠肝组织SOD、GSH-Px活性并降低MDA含量，并且该作用具有剂量依赖性，提示牛磺酸能剂量依赖性地抑制肝硬化门静脉高压大鼠肝组织氧化应激损伤。

综上，牛磺酸对四氯化碳所致大鼠肝硬化门静脉高压具有剂量依赖性的抑制作用，其机制可能与牛磺酸能有效保肝降酶，抑制氧化应激损伤，上调eNOS表达、提高NO含量，改善肝功能有关。

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（修回日期：2015-11-15；编辑：华强）

Effects of Taurine on Rats with CCl4-induced Portal Hypertension

LI Jing， YANG Ya-juan，
LI Chang-juan， FENG Yan （First Hospital of Handan， Handan 056002， China）

Objective To investigate the effects of taurine on rats with CCl4-induced portal hypertension； To discuss its mechanism of action. Methods CCl4compound method was used to prepare portal hypertension rat models. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group， positive medicine group and low-，medium- and high-dose taurine groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. After four-week treatment， biochemical analyzer was used to detect the contents of ALT， AST and TBIL； ELISA was used to detect the contents of CⅣ， PCⅢ， LN， HA and the level of HYP in serum； hemodynamic method was used to detect PVP， PVF， MAP and HR； nitrate reduction method was used to detect the contents of NO， chemical colorimetry was used to detect the activity of eNOS， hepatic tissue； the activity of SOD， GSH-Px and the content of MDA in hepatic tissue； HE staining was used to observe the histopathological changes of the hepatic tissue. Results Compared with the model group， the contents of ALT， AST and TBIL in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the contents of CⅣ， PCⅢ， HA and HYP in serum in medium- and high-dose taurine groups decreased significantly， and LN in high-dose taurine group decreased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the PVP，PVF in medium- and high-dose taurine groups and the HR in high-dose taurine group decreased significantly （P＜0.01）， and the MAP in high-dose taurine group inecreased significantly （P＜0.05）； the content of NO in hepatic tissue of medium- and high-dose taurine groups increased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the activity of eNOS and the content of cGMP in high-dose taurine group increased significantly （P＜0.05）； the activity of SOD， GSH-Px inhepatic tissue of medium- and high-dose taurine groups increased significantly and the content of MDA decreased significantly （P＜0.05， P＜0.01）； the hepatic tissue histopath-ological changes of low-， medium- and high-dose taurine groups were significantly improved， especially the high-dose taurine group. Conclusion Taurine has inhibitory effects on rats with portal hypertension， which perhaps are related to its effects on enzyme activity inhibition and hepatic tissue protection， inhibiting the damage of oxidative stress， upregulating eNOS expression， enhancing the content of NO and improving liver function.

taurine； CCl4； cirrhosis； portal hypertension； rats

R285.5

A

1005-5304（2016）09-0065-05

2015-10-18）