鞘内注射右美托咪定对利多卡因致大鼠脊髓神经毒性的影响

吴春娴

鞘内注射右美托咪定对利多卡因致大鼠脊髓神经毒性的影响

吴春娴

目的 探讨鞘内（蛛网膜下腔）注射右美托咪定（DEX）对利多卡因致大鼠脊髓神经毒性的影响。方法 健康清洁级雄性大鼠30只，体重250～300g，按随机数字表法，随机分为5组（n=6）：空白对照组（C组）、假手术组（S组）、利多卡因致神经毒性组（L组）、生理盐水组（NS组）、右美托咪定（60μg/kg）组（LD组）。除C组外，其余各组均行鞘内置管。在鞘内置管后第1天，除S组外，均鞘内注射20%利多卡因20μl。注射24h后，NS组鞘内注射生理盐水20μl，LD组鞘内注射DEΧ20μl，1次/d，连续7d。术后第8天取脊髓组织采用流式细胞仪测定神经元凋亡率，采用RT-PCR法测定caspase-3 mRNA的表达；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脊髓组织肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）的含量。结果 与C组比较，L组、NS组、LD组，细胞凋亡率明显升高；与L组比较，LD组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与C组比较，L组、NS组、LD组，caspase-3mRNA表达明显上调；与L组比较，LD组caspase-3mRNA表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与C组比较，L组、NS组、LD组，TNF-α、IL-1、 IL-6含量明显升高；与L组比较，LD组TNF-α、IL-1、 IL-6含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 鞘内注射DEX（60μg/kg）可减轻利多卡因诱发大鼠脊髓神经毒性，其机制可能与抑制caspase-3 mRNA的表达，减轻炎症反应有关。

右美托咪定 利多卡因 脊神经 细胞凋亡 炎症反应

局麻药物的神经毒性反应是临床常见的并发症，多数表现为短暂的神经功能障碍，严重的可引起马尾综合征甚至瘫痪。右美托咪定（DEX）是高选择性a受体激动药，在临床麻醉中用于镇静和镇痛。研究表明［1］，DEX可减轻组织器官炎症反应，对组织器官具有一定的保护作用：Lai等［2］证实高于临床剂量的DEX可抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6，并诱导巨噬细胞分泌IL-10，具有减轻炎症反应保护组织器官的作用。2015年3月至11月作者通过实验研究，探讨鞘内注射右美托咪定对利多卡因诱发大鼠脊髓神经毒性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性大鼠30只，体重250～300g，8～10周龄，由宁波大学动物实验中心提供。

1.2 实验方法 健康清洁级雄性大鼠30只，按随机数字表法分为5组，空白对照组（C组）、假手术组（S组）、利多卡因致神经毒性组（L组）、生理盐水组（NS组）、右美托咪定（60μg/kg）组（LD组），每组各6只。除C组外，其余各组均行鞘内置管。在鞘内置管后第1天，除S组外，剩均鞘内注射20%利多卡因20μl。在利多卡因注射后24h，NS组鞘内注射生理盐水20μl，LD组鞘内注射DEΧ20μl，1次/d，连续7d。术后第8天取脊髓组织采用流式细胞仪测定神经元凋亡率，采用RT-PCR法测定caspase-3 mRNA的表达；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脊髓组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）的含量。

1.3 鞘内置管 除C组外，其余各组参考文献［3］均行鞘内置管。术毕第1天鞘内注射20%利多卡因20μl，＜30s出现双后肢瘫痪为利多卡因筛选实验阳性，同时若钳夹双前肢，躲避反应存在，而双后肢无反应，夹尾反射消失，则选入实验。排除不符合实验条件的大鼠。

1.4 观察指标 （1）细胞凋亡的测定：鞘内注射利多卡因7d后，每组随机取3只大鼠，快速断头处死，取L4～5脊髓组织，预冷PBS液冲洗脊髓组织，无菌研磨1min，细胞团块过滤2次后离心去血清，加入碘化丙啶避光反应30min，采用FACS Calibur流式细胞仪测定神经元细胞凋亡率（凋亡细胞数÷总细胞数×100%）。（2）caspase-3 mRNA表达的测定：采用RT-PCR法测定caspase-3 mRNA的表达。（3）脊髓组织TNF-α、IL-1、IL-6含量测定：于术后第8天取脊髓L4～5椎体，以充满50ml生理盐水的注射器从骶段椎管插入3～4 mm，将脊髓冲出，称重后匀浆，分离上清液。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定脊髓TNF-α、IL-1 和IL-6 的含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与C组比较，L组、NS组、LD组，细胞凋亡率明显升高；与L组比较，LD组细胞凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与C组比较，L组、NS组、LD组，caspase-3mRNA表达明显上调；与L组比较，LD组caspase-3mRNA表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与C组比较，L组、NS组、LD组，TNF-α、IL-1、 IL-6含量明显升高；与L组比较，LD 组TNF-α、IL-1、 IL-6含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞凋亡率、caspase-3mRNA表达及检测指标比较（±s）

表1 各组细胞凋亡率、caspase-3mRNA表达及检测指标比较（±s）

注：与C组比较，*P＜0.05；与L组比较，#P＜0.05

组别细胞凋亡率（%）caspase-3mRNATNF-α（pg/mg）IL-1（pg/mg）IL-6（pg/mg）C组2.13±0.22 0.49±0.0220.12±3.2155.37±8.26102.57±21.38 S组2.04±0.31 0.43±0.0121.35±2.1850.89±7.6599.65±26.31 L组18.34±4.13* 1.01±0.05*159.37±11.56*281.64±29.67*416.84±31.20* NS组17.85±4.38* 0.98±0.06*150.39±12.34*279.58±21.98*402.95±29.34* LD组8.34±1.86*# 0.60±0.01*#69.34±8.54 *#90.67±15.92*#169.31±26.34*#

3 讨论

利多卡因为酰胺类局麻药。临床上广泛应用于局部麻醉、镇痛等。利多卡因可能会导致神经毒性反应，是临床上常见的并发症，多数表现为短暂的神经功能障碍，严重的可引起马尾综合征甚至瘫痪，利多卡因所致神经毒性具体机制不详，其可能机制有［4］：神经细胞内钙超载，细胞内钙超载可致线粒体功能障碍，线粒体肿胀，功能失调，导致细胞凋亡；如神经细胞长期暴露局麻药下，或利多卡因浓度过高，可引起神经细胞脱髓鞘，进而引起一系列的炎症反应，导致细胞凋亡，从而引发神经毒性等。

右美托咪定（DEX）是高选择性α受体激动药，在临床麻醉中用于镇静和镇痛。最新研究表明［5，6］，右美托咪定可减轻组织器官炎症反应，对组织器官具有一定的保护作用，有研究证实［7］，右美托咪定具有神经保护功能，能够减轻实验动物短暂性整体或局部脑缺血后的神经损伤，推测其可能与降低脑细胞外的儿茶酚胺水平、调节细胞凋亡、减少兴奋性神经递质谷氨酸盐有关。Lai等［2］证实高于临床剂量的DEX可抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6，并诱导巨噬细胞分泌IL-10，具有减轻炎症反应保护组织器官的作用。有研究证实［8～10］，DEX组织器官保护作用，可能与其调控P13K/Akt信号通路有关。

本资料结果显示，与C组比较，L组、NS组、LD组细胞凋亡率明显升高，表明利多卡因诱发大鼠脊髓神经毒性的模型制备成功。与L组比较，LD组细胞凋亡率明显降低，表明DEX在一定程度上，通过一定的途径可以降低细胞凋亡率，但结果显示，DEX并不能完全抑制细胞凋亡，表明鞘内注射DEX可减轻利多卡因所诱发的大鼠脊髓神经毒性。

一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分［11］。研究证实利多卡因可使线粒体功能障碍，导致细胞色素C释放增加，从而激活caspase系统，导致神经元凋亡。局麻药对于神经细胞毒性作用主要表现为诱发细胞凋亡，caspase信号通路激活是细胞凋亡的主要途径，其中caspase-3表达与细胞凋亡有较高的相关性，可作为细胞凋亡的标记物。本资料结果显示，与C组比较，L组、NS组、LD组，caspase-3mRNA表达明显上调，与相关报道结果一致，与L组比较，LD组caspase-3mRNA表达下调，表明DEX可抑制caspase-3mRNA的表达，其机制可能与DEX拮抗兴奋性氨基酸毒性、增加自由基清除剂活性、稳定细胞内钙离子浓度等有关。本资料结果显示：与C组比较，L组、NS组、LD组的TNF-α、IL-1、 IL-6含量明显升高；与L组比较，LD组的TNF-α、IL-1、 IL-6含量降低，表明右美托咪定可以减轻神经细胞的炎症反应，对神经细胞具有一定的保护作用。

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11 Radwan IA，Saito S，Goto F.The neurotoxicity of local anesthetics on growing neurons：a comparative study of lidocaine，bupivacaine，mepiva caine，and ropivacaine.Anesth Analg，2012，94（2）：319～324.

Objective To evaluate the effect of dexmedetomidine（DEX） intrathecal administration on formation of lidocaine-induced neurotoxicity to the spinal cord in rats. Methods Healthy male Sprague-Dawley rats， weighing 250-300g， were randomly divided into 5 groups（n=6）using a random number table: control group （group C）， sham operation group （group S）， lidocaine-induced neurotoxieity group （group L），normal saline group （group NS） and dexmedetomidine （60μg） group （group LD） . A catheter was inserted at L4-5 interspace into the epidural space in S ， L ， NS ， and LD groups . One day after surgery， 20% lidocaine 20μl was injected intrathecally . When lidocaine were injected after 24 hours， normal saline 20μl and DEX 20μl were injectedintrathecally in NS and LD groups， respectively， once a day for 7 consecutive days. The rats were sacrifi ced after the behavioral test was completed at 8 days after lidocaine injection， and the lumbar segments of the spinal cord were removed to detect the neuronal apoptosis （ using flow cytometry ） and caspase-3 mRNA expression （ by RT-PCR ）. Using enzyme-linked immunosorbentassay （ELISA） to detect spinal cord tissue tumor necrosis factor-a （TNF-a） 、interleukin-1 （IL-1） 、interleukin-6 （IL-6） . Results Compared with group C， the apoptosis rate wasincreased and caspase-3 mRNA expression was up-regulated in L、NS and LD groups. Compared with group L， the apoptosis rate was decreased and caspase-3 mRNA expression was down-regulated in LD group. Compared with group C， TNF-a、IL-1and IL-6 content signifi cantly increased in L、NS and LD groups. Compared with group L， TNF-a、IL-1and IL-6 content decreased obviously in LD group. The signifi cant change was found in the parameters mentioned above. Conclusion Intrathecal DEX （60μg） can reduce lidocaine-induced neurotoxicity to the spinal cord in rats. The mechanismthe are related to the inhibition of caspase-3 mRNA expression and the reduction of infl ammatory reation.

Dexmedetomidine Lidocaine Spinal neurons Apoptosisinfl am Matory reaction

·实验研究·

315000 宁波大学医学院附属医院 麻醉科