miR-21 miR-205联合检测对非小细胞肺癌的诊断价值

陈弘磊 王伟⋆ 李芳琼 刘琴 赵桂枝

miR-21 miR-205联合检测对非小细胞肺癌的诊断价值

陈弘磊 王伟⋆ 李芳琼 刘琴 赵桂枝

目的 探讨联合检测血液中microRNA-205（miR-205）和microRNA-21（miR-21）对非小细胞肺癌的诊断价值。方法 收集27例非小细胞肺癌患者术前及术后血清，并收集29例健康志愿者血清作为对照。应用实时荧光定量PCR 法检测以上标本中miR-205和miR-21 的表达水平，并分析其与临床病理特征的相关性，评估miR-205和miR-21联合检测对非小细胞肺癌的诊断价值。结果 非小细胞肺癌患者术前血清中miR-205和miR-21的表达水平均高于健康人群（P< 0.05），其中23例非小细胞肺癌患者术后血清中miR-205的表达水平较术前明显降低（P＜0.01），术前与术后miR-21表达水平无显著性差异（P＞0.05）。而术前血浆中miR-205和miR-21的表达水平与患者淋巴结转移及Dukes分期存在相关性（P<0.05）。miR-205和miR-21 的受试者（ROC）曲线下面积为0.968，非小细胞肺癌患者和健康人群的敏感度和特异度分别为96.3%和89.7%。结论 血清miR-205和miR-21作为新的生物学指标，两者联合检测对非小细胞肺癌的诊断和预后监测有一定价值。

非小细胞肺癌 miR-21 miR-205 联合检测

肺癌是一种全球范围内常见的癌症，出现临床表现时已经是晚期，故有较高的致死率［1］。约75%的肺癌患者在确诊时已经是晚期或癌细胞已经转移，因此肺癌患者5年生存率＜15%［2］。miRNA在血清/血浆中可以稳定存在，表达量不受各种保存条件、保存时间的影响；且miRNA的表达无年龄、性别差异，具有肿瘤特异性［3］。因此，血清/血浆中miRNAs可能成为一种新的非侵入性肿瘤标志物。2013年10月至2015年至5月作者通过实验研究，探讨联合检测血液中miR-205、miR-21对非小细胞肺癌的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 样本 采集EDTA抗凝血浆样本，健康对照组29例，男15例，女14例；年龄（46.3±11.2）岁。肺癌组27例，男16例，女11例；年龄（49.6±9.7）岁。病理诊断均为非小细胞肺癌，术前均未进行过化疗、放疗，1例术后脱落。肺癌患者术前、术后3d分别采集血浆。

1.2 试剂及仪器 血浆miRNA提取采用miRcute miRNA Isolation Kit。反转录试剂盒采用TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit。探针由自行设计并合成；反转录茎环引物、PCR扩增引物由自行设计合成。cel-miR-39购自QIAGEN。BioRad CFX实时荧光定量PCR仪。

1.3 血浆miRNA的提取及cDNA制备 使用miRcute miRNA Isolation Kit提取血浆miRNA，使用TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit反转录成cDNA。

1.4 PCR反应 miRNA反转录为cDNA后，按照下面组分进行PCR反应。循环参数设置：95℃10min预变性，然后95℃15s 和60℃1min退火延伸40个循环。荧光通道检测选择FAM。单点荧光检测在60℃。反应体系为20μl，包括检测试剂混合液（18.5μl）、DSC-Taq DNA聚合酶（0.2μl）、cDNA（1.3μl）。

1.5 统计学方法 采用SPSS软件。计算术前术后ΔmiR-21、ΔmiR-205的差值xi=Ct（术后ΔmiRNA）-Ct（术前ΔmiRNA），然后计算差值的平均数和标准差，并计算T0，并查表得t0.05。若T0＜t0.05，则术前术后无显著差异；若T0＞t0.05，则术前术后差异显著。

2 结果

2.1 肺癌组术前与术后miR-21、miR-205检测结果比较 miR-21术后与术前比较差异无统计学意义，miR-205术后与术前比较差异有统计学意义。见图1、图2、表1。

2.2 两组术前、术后miR-21、miR-205比较 两组术前比较，差异有统计学意义（P＜ 0.01），可用于肺癌的判定；而两组术后比较，miR-21差异有统计学意义，miR-205差异无统计学意义。见表2。

图1 miR-21在术前与术后的表达差异

图2 miR-205在术前与术后的表达差异

表1 肺癌组术前与术后miR-21、miR-205比较

表2 miR-21、miR-205与正常健康组t-test结果比较

2.3 ROC曲线和cut-off值 从图3及表3中可知，曲线下面积为0.968，表明miR-21和miR-205联检对肺癌的判别有意义（P＜0.001）。根据ROC曲线坐标，选择敏感度+特异性最大值-1.435作为cut-off值，此时灵敏度为0.963，特异性为0.897。比较Ct计算公式为：Ct（-ΔmiR-21）×0.578 + Ct（-ΔmiR-205）×0.550，若比较Ct ＞ -1.435，则为肺癌；比较Ct ＜ -1.435，则为健康。

图3 ΔmiR-21、-ΔmiR-205ROC曲线

表3 曲线下面积

3 讨论

微小RNA（miRNAs）是一类核苷酸序列高度保守、长度为21～23nt的非编码单链RNA，主要参与转录后水平的基因调控，介导基因沉默。人类miRNA编码基因有700多个结合位点，而将近1/3基因的表达调控均有miRNA的参与，涉及细胞分化、增殖与凋亡等生命活动的多个进程。miRNA的表达异常能够引发多种疾病，甚至导致肿瘤的发生［4］。研究表明，大量的miRNA位于与肿瘤相关的基因区、杂合性丢失区与扩增区［5］，且在较多恶性肿瘤（如肺癌、肝癌、结肠癌、卵巢癌等）组织中均有异常表达，提示肿瘤发生可能与miRNA有密切关联［6］。

miR-21是miRNA家族中成员之一，成熟的miR-21主要通过与靶mRNA的3'UTP完全或不完全的特异性配对从而影响mRNA的降解，或通过与靶mRNA序列互不配对结合而阻断其翻译过程，最终在转录后水平上调控基因表达［7］。进而调节一系列机体重要的生理过程，包括细胞的增殖、分化与凋亡等。近年来对miR-21与肿瘤的大量研究表明，miR-21在多种肿瘤组织中均有异常表达，典型的有肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌等［8］；研究显示miR-21拥有抗凋亡作用，相当于癌基因功能。有研究表明，在非小细胞肺癌患者的血清中，miR-146b、miR-221、let-7a、miR-155、miR-17-5p、miR-27a、miR-106a的表达量显著下降，而miR-29c的表达量则显著升高［9］。miR-21、miR-210在NSCLC表达谱中通常表现为显著下调［10］。Wang 等［11］认为，与健康组比较，非小细胞肺癌患者血清中的miR-21显著提高。miR-21的高表达水平和淋巴结转移及淋巴结分期相关。

miR-205是miRNA家族中与肿瘤发生密切相关的另一成员，核苷酸序列高度保守，位于人第一号染色体LOC642587位点第二内含子中［12］。miR-205在各种肿瘤中的表达水平并不一致，有研究报道，在前列腺癌和乳腺癌等肿瘤组织中miR-205表达明显下降［13］，而在肺癌组织中表达显著上调。Markou等应用PCR技术对非小细胞肺癌患者研究中，检测到肿瘤细胞中miR-205高表达，但表达量与生存率无关［14］。

本资料结果表明，非小细胞肺癌患者术前miR-21、miR-205均明显升高，采用ROC曲线评估，当cut-off值取-1.435时，灵敏度为96.3%，特异性为89.7%，具有极其良好的对临床非小细胞肺癌的诊断价值。 肺癌患者术前与术后血浆miR-21差异无统计学意义，而miR-205差异有统计学意义，肺癌患者术前与术后miR-21与对照组比较差异有统计学意义，而miR-205术前差异有统计学意义，术后差异无统计学意义。表明血浆miR-21在肺癌术后3d并未立即下降，而miR-205则会立即下降至正常水平，因此miR-205可能为非小细胞肺癌的一个相关的肿瘤指标，可能比其他miR更加灵敏地反映肿瘤的变化。综上所述，联合检测miR-21、miR205能更有效提高非小细胞肺癌的检出率，为术后的治疗效果提供更可靠的依据，有望为肿瘤诊断、治疗及预后过程提供一种新方法。

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Objective To explore the diagnostic value of plasma microRNA-205（miR-205）and microRNA-21（miR-21） in Non-small Cell Lung Cancer. Methods The preoperative plasma specimens from 29 patients with Non-small Cell Lung Cancer and their postoperative （at day 7 after operation） plasma specimens （only 26 cases among them） were collected. At the same time，the plasma specimens from 33 healthy volunteers were used as the controls. The expression of miR-205 and miR-21 in these samples was measured by real-time fl uorescence quantitative-PCR，and its relationship with the clinical characteristics of patients with Non-small Cell Lung Cancer was analyzed. Results The expression level of miR-205 and miR-21 in preoperative plasma from the patients with Non-small Cell Lung Cancer was higher than that from healthy volunteers （P<0.05）. As compared with the preoperative plasma，the expression of miR-205 in postoperative plasma from 23 cases was decreased remarkably （P＜0.01）.however，the expression level of miR-21 in postoperative plasma group and preoperative plasma group didn't signifi cantly differ （P＞0.05）. The expression of miR-205 and miR-21 in preoperative plasma had a signifi cant impact on lymphatic metastasis and Duke's stage （P<0.05）. For discriminating Non-small Cell Lung Cancer patients from healthy volunteers，the area under the receiver operating characteristic curve was 0.968，and the sensitivity and specifi city were 96.3% and 89.7%，respectively. Conclusion Plasma miR-205 and miR-21，as new biomarkers，the combined detection of them may help the diagnosis of non-small Cell Lung Cancer

Non-small Cell Lung Cancer MicroRNAs Diagnosis Plasma MicroRNA-205 MicroRNA-21

·基础研究·

浙江省公益技术研究社会发展项目（2013C33199）

310000 浙江中医药大学（陈弘磊）

310012 浙江省立同德医院（王伟 李芳琼 刘琴赵桂枝）