醇酶法制大豆油废液中异黄酮的纯化及其抗肿瘤作用研究

穆　莹,张晓南,徐　渐,张宏伟

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)



醇酶法制大豆油废液中异黄酮的纯化及其抗肿瘤作用研究

穆莹,张晓南,徐渐,张宏伟

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

用有机溶剂萃取和树脂吸附纯化醇酶法制大豆油废液中的异黄酮,用高效液相色谱检测纯化的异黄酮的纯度。以人乳腺癌细胞系MCF-7为模型,检测纯化的大豆异黄酮对MCF-7增殖的影响。结果表明,萃取法粗提的最佳萃取溶剂为乙酸乙酯与正丁醇(1∶1)的混合液,异黄酮提取率为70.47%,纯度为26.45%;树脂吸附纯化的最佳条件为:树脂型号,LSA-8;上样浓度,0.8 mg/mL;上样流速,0.5 BV/h;洗脱液,75%的乙醇;洗脱流速,6 BV/h;洗脱体积,1.5倍上样体积,异黄酮提取率为83.28%,纯度为71.45%。抗肿瘤实验表明,大豆异黄酮浓度达到100 mg/L时,能显著(p<0.01)抑制MCF-7细胞的增殖,其作用有一定的剂量依赖性。

大豆异黄酮,纯化,抗肿瘤,MCF-7细胞

大豆异黄酮(soybean isoflavone)是大豆生长过程中形成的次生代谢产物,它是一类具有多酚结构的混合物的统称[1-4]。大豆异黄酮是大豆中有效活性物质之一,它表现弱的雌激素双向调节作用,具有抗氧化、抗肿瘤、促进机体生长等多种生理功能[5-8]。有机溶剂萃取和树脂吸附纯化法是常用的生物活性物质提取的方法,其分离纯化过程较简单,效果较好,并且一般不会影响分离物的生物活性[9-10]。大豆在用醇酶法制大豆油后,其副产物往往被作为废物直接丢弃,但这些副产物中含有较丰富的大豆异黄酮,如能合理回收利用则能变废为宝,有效合理的利用大豆资源。本研究以醇酶法制大豆油副产物为原料,通过有机溶剂萃取及树脂吸附法提取大豆异黄酮,并且以人乳腺癌细胞MCF-7为细胞模型,研究大豆异黄酮对乳腺癌细胞增殖的影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

醇酶法制大豆油副产物(本实验室保存):大豆用醇酶法提取大豆油后的废液,其来源工艺如下:

其中下划线标记的上清液即本实验的原材料。

人乳腺癌细胞MCF-7美国ATCC细胞库;DMEM/F12培养基,细胞增殖检测试剂美国Gibco公司;乙腈(色谱纯),甲醇(色谱纯),乙醇(色谱纯),磷酸(分析纯),二甲基亚砜(分析纯),盐酸(分析纯)和萃取用正丁醇,丙酮,乙酸乙酯天津市科密欧化学试剂有限公司;大豆苷,大豆黄苷,大豆异黄酮,大豆素,大豆黄素,染料木素标准品TEDIA公司。

高效液相色谱仪Agilent 1100,Agilient Technologies;色谱柱ODS3 C18,4.6×250 mm,5μm,Phenomenex;旋转蒸发仪N-1000,东京理化;CASY 细胞分析仪德国;CO-150型CO2培养箱日本三洋;各型号大孔树脂国产。

1.2实验方法

1.2.1大豆异黄酮标准曲线的建立参照国标GB/T 23788-2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法》[11]。其方法与色谱条件如下:分别取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素对照品各4 mg,分别置于10 mL容量瓶,加入50%二甲基亚砜至接近刻度,超声处理30 min后用二甲基亚砜定容制成标准储备液,各标准储备液的浓度均为400 mg/L。

8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 mg/L混合标准储备液配制:分别吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准储备液各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中,加入等体积的水后,再加入50%二甲基亚砜溶液定容。

色谱条件色谱柱:ODS3 C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:流动相A:乙腈(色谱纯);流动相B:磷酸水溶液(pH3.0,0.45 μm膜过滤)。A,B流动相用前均超声30 min脱气。洗脱条件:见表1。流速:1.0 mL/min;波长:260 nm;进样量:10 μL;柱温:30 ℃。

表1　梯度洗脱条件

1.2.2萃取法初步纯化大豆异黄酮本实验以醇酶法生产大豆油的副产物为原材料,以有机溶剂萃取法对原材料中的大豆异黄酮进行粗提。所选有机溶剂为正丁醇,丙酮和乙酸乙酯。萃取方法如下:取醇酶法制大豆油后的上清醇液200 mL,旋转蒸发去除乙醇,浓缩液用6 mol/L的盐酸调pH至4.5,冷藏72 h,3600 r/min离心15 min。取上清加水至总体积为200 mL,此即为大豆异黄酮原料液。此原料液一部分真空干燥用于液相色谱检测,另一部分用于后续分离纯化。

取200 mL上述原料液,加200 mL萃取溶剂,25 ℃震荡后静置萃取,分离萃取上清。大豆异黄酮富集在上清中。萃取3次,合并3次萃取上清的体积,真空干燥,称重。液相色谱检测萃取产物中大豆异黄酮含量,计算大豆异黄酮的提取率和纯度。实验重复3次[12]。

大豆异黄酮提取率(%)={[纯化后样液中大豆异黄酮的含量(mg/g)]/[原料液中大豆异黄酮的含量(mg/g)]}×100

大豆异黄酮纯度(%)=[纯化后样液中大豆异黄酮的质量(mg)/纯化干燥品总质量(mg)]×100

1.2.3树脂吸附法精制大豆异黄酮本实验将萃取后干燥的异黄酮样品用离子水溶解,配制成0.6 mg/mL的浓度,在pH为7.0的条件下,35 ℃对样品溶液进行静态吸附24 h,然后用90%乙醇静态洗脱,以树脂的吸附量、吸附率、大豆异黄酮纯度和提取率为考察指标,考察LSA-8、P2002-6、DM130、ADS-22、D100等5种型号的树脂对大豆异黄酮纯化效果的影响。

树脂吸附率(%)={[初始溶液中大豆异黄酮含量(mg)-树脂吸附后溶液中大豆异黄酮含量(mg)]/初始溶液中大豆异黄酮含量(mg)}×100

树脂吸附量(mg大豆异黄酮/g干树脂)=[初始溶液中大豆异黄酮含量(mg)-树脂吸附饱和后溶液中大豆异黄酮含量(mg)]/树脂干重(g)

树脂解吸率(%)={洗脱液中大豆异黄酮含量(mg)/[初始溶液中大豆异黄酮含量(mg)-树脂吸附后溶液中大豆异黄酮含量(mg)]}×100

选择好树脂后,本实验以树脂对大豆异黄酮的吸附率、解吸率为考察指标,从样品上样浓度、上样流速、洗脱液中乙醇浓度、洗脱流速、洗脱体积等方面优化大豆异黄酮的纯化条件。进行单因素实验时,先固定其他因素。HPLC检测纯化产物中大豆异黄酮含量,计算大豆异黄酮的提取率和纯度。实验重复3次。

实验中设计的样品浓度为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL;样品流速为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 BV/h;洗脱液中乙醇浓度为60%、65%、70%、75%、80%、85%和90%;洗脱流速为2、4、6、8、10 BV/h;洗脱体积为上样体积的1、1.5、2、2.5倍。

1.2.4大豆异黄酮抗肿瘤活性分析将纯化的大豆异黄酮干燥品用DMEM/F12培养液溶解,分别配置成含大豆异黄酮浓度为0、10、100、200、300 mg/L的DMEM/F12培养液待用。将MCF-7细胞以1×105/mL培养液的密度接种至六孔板中,6孔板中的随机5个孔分别标记1、2、3、4和5。待细胞生长到80%左右汇合度时,去掉培养液,细胞用D-Hanks液洗细胞3遍,然后在标记数字的空中按数字顺序分别添加含大豆异黄酮浓度为0、10、100、200、300 mg/L的DMEM/F12培养液,培养48 h后收集各组细胞进行实验。各组细胞样品用CASY细胞分析仪检测细胞数与细胞活力(经制样处理后活细胞数占总细胞数的百分比)。每组均设3个平行。

1.2.5数据统计与分析实验数据用Microsoft Excel进行统计分析,用单因素方差分析组间差异,结果用“平均值±标准差”表示。

2　结果与分析

2.1大豆异黄酮标准曲线的建立及原液中大豆异黄酮含量检测

2.1.1标准曲线建立与原料液中大豆异黄酮含量检测按国标要求配制各组分浓度为8～40 mg/L的混合标准品,通过高效液相色谱建立标准曲线方程,如表2和图1所示,在标准品浓度范围内,经重复进样,R2均在0.9999,在此范围内标准曲线相关系数高(R2≥0.9999),线性范围较广,可以用来进行分析。

表2　大豆异黄酮标准曲线

图1　混合标准品色谱图(24.0 mg/L)Fig.1　The chromatogram of mixed standard product(24.0 mg/L)注:图中峰1～6分别为大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的峰图,图2同。

将原料液烘干品按国标要求稀释,高效液相色谱检测其大豆异黄酮的含量(图2),根据标准曲线计算结果表明,样品原液中大豆异黄酮的总含量为0.4135 mg/mL,其中绝大部分为大豆苷和染料木苷。

图2　样品色谱图Fig.2　The chromatogram of sample

2.2萃取法初步纯化大豆异黄酮

实验通过前期预备实验发现用乙酸乙酯、正丁醇和丙酮对原料液进行等体积萃取效果均不理想,正丁醇萃取纯度高但提取率低,而乙酸乙酯则反之,故实验设计正丁醇和乙酸乙酯的混合溶剂来萃取大豆异黄酮,以纯度×提取率为检测指标。结果如图3所示,正丁醇和乙酸乙酯的体积比为1∶3时,大豆异黄酮纯度为12.39%,提取率为75.83%,综合指标为939.53;正丁醇和乙酸乙酯的体积比为3∶1时,大豆异黄酮纯度为30.18%,提取率为55.12%,综合指标为1663.52;而正丁醇和乙酸乙酯的体积比为1∶1时,大豆异黄酮纯度为26.45%,提取率为70.47%,综合指标为1863.93,明显高于其他比例组合的综合指标。所以本实验选用正丁醇和乙酸乙酯体积比为1∶1的混合溶剂作为萃取溶剂对原料液中大豆异黄酮进行萃取。

图3　不同比例的正丁醇和乙酸乙酯混合溶剂萃取大豆异黄酮的效果Fig.3　The result of extraction of soybean isoflavoneby the mixed solvents of different volume ratio of butyl alcohol and ethyl acetate

大豆异黄酮可溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇溶液中,而皂甙类物质难溶于丙酮等有机溶剂,多糖、单糖及小分子蛋白质也难溶于乙酸乙酯和正丁醇等溶剂,利用此性质采用溶剂萃取法可以初步纯化大豆异黄酮[13]。袁建[14]等实验发现以氯仿、苯、乙醚作为萃取剂时,大豆异黄酮萃取效率较低;以正丁醇萃取时萃取率高,但萃取液中杂质较多;而以乙酸乙酯萃取时萃取率稍低,但萃取液中杂质较少。本实验选用体积比为1∶1的正丁醇和乙酸乙酯作为萃取剂,主要是考虑了大豆异黄酮的萃取率,但同时在一定程度上又兼顾了纯度。

2.3树脂吸附法精制大豆异黄酮

2.3.1吸附树脂的选择实验从LSA-8、P2002-6、DM130、ADS-22、D100等5种型号的树脂中进行选择,以树脂的吸附量、吸附率、纯化后大豆异黄酮纯度和提取率为考察指标。实验结果如图4所示,LSA-8型号的树脂在各个指标上均显著优于其余四种型号的树脂。因此,本实验选择LSA-8型号的树脂对大豆异黄酮进行分离纯化。

图4　不同树脂对大豆异黄酮的吸附效果 Fig.4　The result of extraction of different resins for soybean isoflavone注:A:不同树脂对大豆异黄酮的吸附量;B:不同树脂对大豆异黄酮的吸附率;C:不同树脂吸附纯化后,大豆异黄酮的纯度;D:不同树脂吸附纯化后,大豆异黄酮的提取率。

2.3.2上样浓度及上样流速对大豆异黄酮纯化的影响以不同上样浓度和流速为因素进行单因素实验,考察上样浓度和流速对LSA-8吸附能力的影响。图4A结果表明,上样浓度为0.4～0.8 mg/mL时,随上样浓度的增加,LSA-8对大豆异黄酮的吸附变化不明显;上样浓度在0.8～1.2 mg/mL时,随上样浓度的增加,LSA-8对大豆异黄酮的吸附显著下降,故最佳上样浓度应为0.8 mg/mL。图4B结果表明,上样流速在0.1～0.5 BV/h时,随上样流速的加快,LSA-8对大豆异黄酮的吸附变化不明显;上样流速在0.5～0.9 BV/h时,随上样流速的增加,LSA-8对大豆异黄酮的吸附显著下降,故最佳上样流速应为0.5 BV/h。综合上述结果,在上样浓度为0.8 mg/mL,流速为0.5 BV/h时,LSA-8树脂对大豆异黄酮的吸附效果最好。

图5　上样条件对LSA-8树脂吸附大豆异黄酮的影响Fig.5　The affect of the conditions of the sample on adsorption rate of LSA-8 resin for soybean isoflavone注:A:上样浓度对LSA-8吸附大豆异黄酮的影响;B:上样流速对LSA-8吸附大豆异黄酮的影响。

2.3.2洗脱液中乙醇浓度、洗脱流速及洗脱体积对大豆异黄酮纯化的影响以洗脱液中不同乙醇浓度、不同洗脱流速及不同洗脱体积为因素进行单因素实验,考察洗脱液中乙醇浓度、洗脱流速和洗脱体积对LSA-8解吸能力的影响。图5A结果表明,乙醇浓度在60%～75%时,随乙醇浓度的增加,LSA-8的解吸率逐渐上升;乙醇浓度在75%～90%时,随乙醇浓度的增加,LSA-8的解吸率逐渐降低,故洗脱液的最佳乙醇浓度应为75%。图5B结果表明,洗脱流速在2～6 BV/h时,随洗脱流速的增加,LSA-8的解吸率明显上升;洗脱流速在6～10 BV/h时,随洗脱流速的增加,LSA-8的解吸率没有明显的上升,故洗脱的最佳流速应为6 BV/h。图5C结果表明,洗脱体积为上样体积的1～1.5倍时,随洗脱液的增加,大豆异黄酮的洗脱量也增加;洗脱体积为上样体积的1.5～2.5倍时,随洗脱液体积的增加,大豆异黄酮的洗脱量基本保持不变,故最佳洗脱体积应为上样液体积的1.5倍。综合上述结果,在洗脱液乙醇浓度为75%,洗脱流速为6 BV/h及洗脱体积为上样液体积的1.5倍时,LSA-8树脂对大豆异黄酮的解吸效果最好。

表3　树脂吸附法纯化大豆异黄酮的纯度和提取率

图6　不同洗脱条件对LSA-8树脂对大豆异黄酮解吸的影响Fig.6　The affect of different elution conditions on desorption rate of LSA-8 resin for soybean isoflavone注:A:洗脱液中乙醇浓度对LSA-8树脂解吸的影响;B:洗脱流速对LSA-8树脂解吸的影响;C:洗脱体积对LSA-8树脂解吸的影响。

综合树脂吸附法结果,选用最优条件对萃取法粗提的产物进行纯化,取粗提后的产物1 g,用离子水溶解,在最优条件下对其进行纯化。结果如表3所示,在此条件下,纯化回收大豆异黄酮提取率为83.71%,纯度为72.09%。

大孔树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物,应用大孔树脂对物质进行分离具有吸附快、解吸率高、吸附容量大、洗脱率高等优点。目前,对于用大孔树脂柱层析分离纯化大豆异黄酮的报道也比较多。蔡力[15]等的研究表明,用D4006大孔树脂纯化后,大豆异黄酮纯度为30.58%;牛新春[16]等选用ADS21型大孔树脂纯化大豆异黄酮,在最优条件下得到大豆异黄酮纯度为42.70%;井乐刚[17]等用D4006大孔树脂纯化大豆异黄酮纯度,制得纯度70%以上大豆异黄酮产品;潘廖明[18]等的研究表明,LSA-8型大孔吸附树脂对大豆异黄酮具有较好吸附特性。该树脂对大豆异黄酮的动态最大吸附量为204.6 mg/g干树脂,纯化后大豆异黄酮含量为57.0%。本研究结果表明,在LSA-8、P2002-6、DM130、ADS-22和D100 5种树脂中,LSA-8树脂分离纯化大豆异黄酮效果最好,其最优条件下得到的异黄酮产物中异黄酮纯度为72.09%,显著高于上述报告结果,且提取率为83.71%,也较理想。

图7　不同浓度的大豆异黄酮对MCF-7细胞增殖的影响Fig.6　The affect of different concentrations of soy isoflavones on the proliferation of MCF-7 cells注:柱形图中,上标不同小写字母表示差异极显著(p<0.01);相同小写字母表示差异不显著(p>0.05),A:不同浓度大豆异黄酮处理后细胞数的变化;B:不同浓度大豆异黄酮处理后细胞活力的变化。

综合上述结果,醇酶法制大豆油副产物中大豆异黄酮的分离纯化的最佳条件及结果如下:萃取法粗提的最佳萃取溶剂为乙酸乙酯与正丁醇(体积比1∶1)的混合液,萃取后大豆异黄酮纯度为26.45%,提取率为70.47%;树脂吸附法纯化的最佳条件为:树脂型号,LSA-8,上样浓度,0.8 mg/mL,上样流速,0.5 BV/h,洗脱液,75%的乙醇,洗脱流速,6 BV/h,洗脱体积,1.5倍上样体积,该条件下,异黄酮纯度为72.09%,提取率为83.71%。

2.4大豆异黄酮抗肿瘤活性

实验检测了添加不同浓度的大豆异黄酮对MCF-7细胞增殖的影响。结果如图7所示,添加大豆异黄酮浓度为10 mg/L时,与空白组细胞比较,实验组细胞的细胞数和细胞活力无显著差异(p>0.05),这说明低浓度的大豆异黄酮对人乳腺癌细胞的增殖没有抑制效果;添加大豆异黄酮浓度为100、200、300 mg/L时,与空白组细胞比较,各实验组细胞的细胞数和细胞活力均显著下降(p<0.01),且添加浓度越高,下降越明显,这说明在浓度≥100 mg/L时,大豆异黄酮对人乳腺癌细胞的增殖有显著的抑制效果,且其效果有浓度依赖性。根据文献报道,大豆异黄酮能通过抑制癌细胞的增殖来发挥其抗癌作用[19-22]。本实验用MCF-7细胞验证了大豆异黄酮对人乳腺癌细胞的抑制增殖作用。

3　结论

萃取法粗提的最佳萃取溶剂为乙酸乙酯与正丁醇(体积比1∶1)的混合液,萃取后大豆异黄酮纯度为26.45%,提取率为70.47%;树脂吸附纯化的最佳条件为:树脂型号,LSA-8;上样浓度,0.8 mg/mL;上样流速,0.5 BV/h;洗脱液,75%的乙醇;洗脱流速,6 BV/h;洗脱体积,1.5倍上样体积,异黄酮提取率为83.28%,纯度为71.45%。抗肿瘤实验表明,大豆异黄酮浓度达到100 mg/L时,能显著(p<0.01)抑制MCF-7细胞的增殖,其作用有一定的剂量依赖性。

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Extraction of soybean isoflavone from byproducts of enzyme-assisted alcohol leaching soybean oil and its activity of anticancer

MU Ying,ZHANG Xiao-nan,XU Jian,ZHANG Hong-wei

(Food Science College of northeast agricultural university,Harbin,Heilongjiang,150030)

The isoflavone was purificated from byproducts of enzyme-assisted alcohol leaching soybean oil by organic solvent extraction and resin adsorption. The purity of isoflavone was investigated by high performance liquid chromatography(HPLC). The human breast cancer cell line MCF-7 was used as the model cells and the affect of soybean isoflavone on the proliferation of MCF-7 cells were studied. The result showed that the optimum extraction solvent for purification of soybean isoflavone was ethyl acetate and n-butyl alcohol mixture(1∶1)and the extraction rate and purity of isoflavone were 70.47% and 26.45%,respectively. The optimum conditions of resin adsorption for extraction of isoflavone were as follows:the adsorption resin was LSA-8,the concentration and flow rate of the sample were 0.8 mg/mL and 0.5 BV/h,respectively,the eluent solution was 75% ethanol and the flow rate and volume of eluent solution were 6 BV/h and 1.5 times of the sample volume,respectively. The extraction rate and purity of soybean isoflavone under the optimal condition of resin adsorption extraction were 83.28% and 71.45%,respectively. The MCF-7 cell experiments suggested that when the concentration of soybean isoflavone was up to 100 mg/L,it could significantly inhibit the proliferation of human breast cancer cell. And the anticancer function of soybean isoflavone was concentration-dependent.

soybean isoflavone;purification;anticancer;MCF-7 cells

2015-05-15

穆莹(1982-)，女，硕士研究生，实验员，研究方向：食品科学与工程，E-mail:my1982123456@163.com。

TS229

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000