响应面法优化美味牛肝菌蛋白质的酶解工艺

郭　磊,刘　辰,李　娜,郭　娟,阚　欢,刘　云

(西南林业大学西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室,云南昆明 650224)



响应面法优化美味牛肝菌蛋白质的酶解工艺

郭磊,刘辰,李娜,郭娟,阚欢,刘云

(西南林业大学西南山地森林资源保育与利用省部共建教育部重点实验室,云南昆明 650224)

为提高美味牛肝菌的食用价值,在单因素实验的基础上,选取酶解时间、酶解温度和料液比为影响因素,以美味牛肝菌蛋白质的水解度作为响应值,通过三因素三水平的Box-Behnken响应面分析法优化美味牛肝菌酶解条件。结果表明,最佳工艺条件为酶解时间5 h、酶解温度50 ℃、料液比1∶36,在此条件下,蛋白质水解度达到47.37%。水解液富含多种营养物质,可进一步加工为美味牛肝菌调味品。

美味牛肝菌,蛋白质,水解,响应面法

美味牛肝菌(BoletusedulisBull.)属于担子菌门(Basidiomycota)、层菌纲(Hymenomycetes)、牛肝菌目(Boletales)、牛肝菌科(Boletaceae)、牛肝菌属(Boletus)。美味牛肝菌是一个广布种,分布于日本、欧洲、北美和澳大利亚,我国见于吉林、黑龙江、江苏、河南、贵州、四川、云南、西藏、湖北、湖南等地区[1]。目前,认为牛肝菌是一类与栎和松等树种根系共生形成外生菌根的真菌类群,迄今为止,除个别种有人工报道在实验室条件下栽培成功外[2],绝大多数种类不能通过人工栽培形成子实体[3]。牛肝菌种类以云南为最多,有219种,占总种数的55.2%[4],其菌肉厚而细软,味道鲜美,营养丰富,是人们最喜欢的野生食用菌之一[5]。

20世纪80年代迄今,国内外学者对美味牛肝菌的生物学特性、化学成分、药理作用及应用进行了大量研究,其药用价值受到广泛重视[6]。美味牛肝菌含有蛋白质[7]、脂肪[8]、黄酮类化合物[9],三萜类化合物[10],多糖[11]等多种营养成分,长期食用能增强机体免疫力,具抗肿瘤、抗突变、降血脂、抗病毒等作用。

近年来,随着人们生活水平的提高和消费观念的改变,食用菌提取物具有很大的开发利用价值[12]。国内有研究者应用酶解技术对香菇、蘑菇、茶树菇等食用菌进行了酶解工艺的研究[13-15],为食用菌的精深加工提供了一定的理论依据。施汉钰等[16]通过对美味牛肝菌液体发酵技术的研究,研发出具有其子实体特点的配制酒的生产工艺。吕红英[17]通过实验确定美味牛肝菌菌丝体液态发酵的优化条件,利用发酵液研究出美味牛肝菌液体菌醋。李艳利等[18]以美味牛肝菌和云南特色土鸡肉为主要原料,炖制出滋味好、香气浓、色泽佳的牛肝菌土鸡汤。本文采用复合酶法水解美味牛肝菌工艺条件的研究,探索酶解工艺参数对美味牛肝菌蛋白质水解度的影响,确定最佳工艺条件,为复合酶解法酶解蛋白质工艺的产业化提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

美味牛肝菌云南易门县康源菌业有限公司;风味蛋白酶(2×104U/g),纤维素酶(2×104U/g)南宁庞博生物工程有限公司;甘氨酸,茚三酮显色剂,无水乙醇,以上均为分析纯。

HH-2型数显恒温水浴锅国华电器有限公司;DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司;BT224S电子天平,酸度计北京赛多利斯仪器系统有限公司;电子万用炉北京市永光明医疗仪器有限公司;UV-2600型紫外分光光度计岛津仪器(苏州)有限公司;高速冷冻离心机SIGMA公司。

1.2实验方法

1.2.1美味牛肝菌的酶解参照杨文博[19]采用茚三酮法测定蛋白质的水解度,绘制甘氨酸标准曲线,并计算蛋白质的水解度。

水解度(%)=水解液中氨基氮含量/总氮量×100

1.2.2单因素实验以水解度为指标,采用单因素实验,探讨酶解时间、酶解温度、料液比、复合酶(纤维素酶和风味蛋白酶)比例、初始pH等因素对云南美味牛肝菌酶解效果的影响。复合酶解的因素设以下水平:固定酶解温度55 ℃,料液比1∶30(g/mL,下同),复合酶(纤维素酶:风味蛋白酶)比例50∶50(体积比,下同),pH6,考查不同的酶解时间(3、4、5、6、7 h)对水解度的影响;固定酶解时间5 h,料液比1∶30,复合酶比例50∶50,pH6,考查不同的酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)对水解度的影响;固定酶解时间5 h,酶解温度50 ℃,复合酶比例50∶50,pH6,考查不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)对水解度的影响;固定酶解时间5 h,酶解温度50 ℃,料液比1∶30,pH6,考查不同的复合酶比例(100∶0、80∶20、50∶50、20∶80、0∶100)对水解度的影响;固定酶解时间5 h,酶解温度50 ℃,料液比1∶30,复合酶比例50∶50,考查不同的初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)对水解度的影响。

1.2.3Box-Benhnken中心组合实验设计在单因素实验的基础上,选择对酶解效果影响较大的三个因素,每个因素选取三个水平,根据Box-Behnken实验设计原理,采用3因素3水平的响应曲面分析方法,以水解度为响应值,实验因素与水平设计见表1。共17个实验点,其中12个为析因点,5个为中心点。

表1　因素水平表Table 1　Variables and levels in the three-variable/three-level central composite design

1.2.4数据处理采用F检验对实验数据进行方差分析以评价模型的统计意义,数据分析软件采用Design Expert 6.0.5。

2　结果与分析

2.1甘氨酸标准曲线的绘制

在570 nm波长下测定吸光度,以吸光度(A)为纵坐标,甘氨酸标准溶液浓度(C)为横坐标,得出标准曲线及回归方程:C=0.0211A-0.0076,R2=0.9996,线性范围在0～20 μg/mL。

图1　甘氨酸标准曲线Fig.1　Standard curve of glycine

2.2单因素实验

2.2.1时间对酶解效果的影响由图2可知,随着酶解时间的延长,蛋白质水解度随酶解时间的增加呈先增大后降低的趋势,酶解时间在5 h时,水解度达到46.04%。之后随时间的延长,可酶解蛋白质的浓度差逐渐降低,同时可能还有一些细胞未被破坏,导致水解度降低且变化较小,因此最适酶解时间为5 h。

图2　时间对蛋白质水解度的影响Fig.2　Effect of hydrolysis time on the DH

2.2.2温度对酶解效果的影响由图3可知,酶解温度40～50 ℃,蛋白质水解度不断升高,温度为50 ℃时水解度达到47.28%,50 ℃之后水解度明显下降。酶解温度是影响酶促反应的一个重要因素,温度的升高会加快酶促反应,但温度超过了酶的最适反应温度时会降低酶促反应的速率,另外蛋白质可能由于温度的升高而变性,故最适的酶解温度是50 ℃。

图3　温度对蛋白质水解度的影响Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on the DH

2.2.3料液比对酶解效果的影响从图4可知,蛋白质水解度随着料液比的增加呈先增大后减小的趋势,当料液比达到1∶30时,水解度达到最大值43.56%。但随着料液比的增加,酶解的蛋白质浓度降低导致水解度降低,故最适的料液比为1∶30。

图4　料液比对蛋白质水解度的影响Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the DH

2.2.4复合酶比例对酶解效果的影响从图5可知,蛋白质水解度随着复合酶中风味蛋白酶比例呈先缓慢增大后缓慢减小的趋势,变化幅度较小,当复合酶比例达到50∶50时,水解度达到最大值47.28%。随着风味蛋白酶比例的增加,纤维素酶比例的下降,蛋白质不能很好的被溶出导致水解度降低,故最适的复合酶比例为50∶50。

图5　复合酶比例对蛋白质水解度的影响Fig.5　Effect of composite enzyme ratio on the DH

2.2.5初始pH对酶解效果的影响从图6可知,蛋白质水解度随着初始pH的增加呈先缓慢增大后缓慢减小的趋势,变化幅度较小,当pH达到6时,水解度达到最大值46.04%。随着初始pH的增加,pH影响了酶的最佳反应条件,导致蛋白质的水解度降低,故最适的初始pH为6。

图6　初始pH对蛋白质水解度的影响Fig.6　Effect of pH on the DH

从图2～图6中可知,复合酶比例及初始pH对蛋白质水解度影响很小,故本研究以影响蛋白质水解度较大的三个因素酶解时间、酶解温度、料液比为自变量进行响应面分析来优化蛋白质的酶解工艺。

2.3酶解的响应面实验结果及数据分析

2.3.1响应面实验方案及结果在单因素实验结果的基础上,由Design-Expert 6.0.5统计分析软件设计出的实验方案及实验结果如表2所示,以蛋白质水解度为响应值,以影响蛋白质水解度较大的三个因素酶解时间(A)、酶解温度(B)、料液比(C)为自变量,建立三因素三水平中心组合实验设计共包括17个实验方案,其中12个析因实验点,5个中心实验点,用以计算实验误差。

表2　Box-Behnken实验设计及其实验结果Table 2　Arrangement and results of the three-variable/three-level central composite design

2.3.2回归方程拟合及方差分析采用Design-Expert 6.0.5统计软件对所得数据进行回归分析,回归分析结果见表3,对各因素回归拟合后,得到回归方程:

表3　回归模型及方差分析Table 3　Analysis of variance of regression equation

注:**p<0.01极显著;*p<0.05为显著。

Y=45.79+0.57A-0.41B+10.59C+0.063AB-0.25AC-0.43BC-11.14A2-9.39B2-17.68C2

2.3.3响应面图分析通过上述二次多项回归方程所做的相应曲面图见图7。通过该组动态图即可对任何两因素交互影响酶解效应进行分析与评价,并从中确定最佳因素范围。

图7　两因素的交互作用对多糖得率的响应面图Fig.7　Response surface plots of variable parameters on the yield of polysaccharides

图7三个图分别显示了料液比,酶解温度,酶解时间为零水平时,酶解时间和温度、酶解时间和料液比、酶解温度与料液比对美味牛肝菌蛋白质水解度的交互影响效应。由图7可知,水解度随其中任意两个变量的增加均呈上升趋势,达到某一定值时,曲面稍下降或趋于平缓。

2.3.4验证实验对回归方程求解,即蛋白质水解度达到最大值时的酶解条件为酶解时间5.04 h、酶解温度49.7 ℃、料液比1∶36 (g/mL),最大水解度达到47.39%,为方便实际操作将实验条件定为酶解时间5 h、酶解温度50 ℃、料液比1∶36 (g/mL)。取三等份云南美味牛肝菌干燥粉末进行平行验证实验,验证实验所得平均水解度为47.37%。结果表明,经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合,证明用响应面法可以有效的优化云南美味牛肝菌的酶解工艺。

3　结论

本研究在单因素的基础上,以蛋白质的水解度为指标,通过三因素三水平的响应面分析法对美味牛肝菌的酶解工艺进行了优化,建立了蛋白质水解度的回归模型,由该模型优化的蛋白质酶解条件为酶解时间5 h、酶解温度50 ℃、料液比1∶36 (g/mL)。在此酶解条件下,蛋白质水解度为47.37%,与模型预测结果接近,进一步验证了该模型的可靠性。实验证明,响应面分析法可以有效的优化美味牛肝菌的酶解工艺条件,对工业化生产具有一定的指导意义。

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Optimization of enzymatic hydrolysis conditions ofBoletusedulisproteins by response surface methodology

GUO Lei,LIU Chen,LI Na,GUO Juan,KAN Huan,LIU Yun

(Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

In order to improve the edible value ofBoletusedulis,hydrolysis-time,hydrolysis-temperature and solid-liquid ratio were studied on the basis of single factor experiment,a central composite design(CCD)involving 17 experiments of three variables(i.e.,hydrolysis-time,hydrolysis-temperature and solid-liquid ratio)at three levels combined with response surface methodology was employed to attain the highest degree of hydrolysis(DH). When the optimal hydrolysis-time,hydrolysis-temperature and solid-liquid ratio were 5 h,50 ℃,1∶36,respectively. Under these conditions,the degree of hydrolysis was 47.37%. The hydrolysate was rich in many nutrients,and it could be used for condiment.

Boletusedulis;protein;hydrolysis;response surface methodology

2016-02-01

郭磊(1981-)，男，硕士，讲师，研究方向：食品资源开发及利用，E-mail：guoleigift.student@sina.com。

云南省教育厅科学研究基金理工类重点项目(2015Z142)；云南省“卓越工程师教育培养计划”建设项目(514006110)。

TS255.5

B

1002-0306(2016)15-0213-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.033