蜂胶对大鼠实验性脂肪肝的疗效及其机制

王　瑶， 杨　彪， 李　卓*

(1西安医学院第一附属医院检验科，西安　710077； 2西安医学院第一附属医院骨科； *通讯作者，E-mail：Lizhuo721@163.com)



蜂胶对大鼠实验性脂肪肝的疗效及其机制

王瑶1， 杨彪2， 李卓1*

(1西安医学院第一附属医院检验科，西安710077；2西安医学院第一附属医院骨科；*通讯作者，E-mail：Lizhuo721@163.com)

目的观察蜂胶对大鼠实验性脂肪肝的疗效，并分析其作用原理。方法50只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、蜂胶低剂量组、高剂量组、易善复组。除正常组外，其余各组采用喂食高脂乳液(1 ml/100 g)+喂食含56%酒精的酒溶液(1 ml/100 g)+腹腔注射10%的CCl4菜籽油溶液(0.08 ml/100 g)的方法，使大鼠产生脂肪肝。所有大鼠于末次给药后禁食16 h，股动脉取血，检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平；计算肝脏器系数，做肝组织病理学检验。结果利用喂食高脂乳液+喂食56%的酒溶液+腹腔注射CCl4菜籽油溶液的方法，可使大鼠产生脂肪肝，完成实验模型建立。相对于模型组，蜂胶高剂量组的TG、AST、TC、ALT、FFA水平下降明显(P<0.05)，且效果优于低剂量组，与易善复组接近；与模型组比较，蜂胶高剂量组的血清炎症因子水平(IL-6、IL-8、TNF-α)也明显降低(P<0.05)；蜂胶高剂量组的肝脏器系数与模型组比较下降明显(P<0.05)，病理结果也显示肝细胞的水肿和坏死现象减轻，脂肪空泡减少。结论蜂胶对大鼠脂肪肝有明显的疗效,其作用机制可能与影响血清炎症因子水平具有一定的关联。

蜂胶；脂肪肝；炎症因子；高脂乳液;大鼠

蜂胶具有多种药理功效，例如：抗肿瘤、抗菌消炎、抗病毒、降血糖、保护肝脏等[1]。近年来，国内外相关领域的专家学者对其保肝功效也展开了广泛的研究，并取得了一定成果。然而，蜂胶在脂肪肝治疗过程中的作用原理尚不明晰。Albukhari等[2]认为蜂胶中的咖啡酸苯乙酯能通过保护细胞膜的完整性，抑制脂质过氧化，增强抗氧化酶的方式保护肝脏。Kart等[3]发现蜂胶能通过降低活性氮和恢复谷胱甘肽水平的方式对抗癌药物顺铂诱导的肝毒性，起到保肝作用。目前，关于脂肪肝诱发因素的研究越来越集中于细胞因子分泌异常这一热点上[4-6]。因此，本研究观察蜂胶对大鼠脂肪肝的治疗作用及对血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α) 的影响研究，探讨了蜂胶在脂肪肝中的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

50只雄性Wistar大鼠，SPF级，体重180-220 g，由西安交通大学医学院提供，动物合格证号：SYXK(陕)2014-005。

1.2主要试剂和仪器

CCl4(成都科龙试剂厂，20141104)；易善复(北京赛诺菲安万特制药公司，20140812)；56°二锅头酒(北京二锅头酒业公司，XK16-030354)；羧甲基纤维素钠(上海三浦化工，20140911)；胆固醇(成都科龙化工试剂厂，20150305)；吐温-80(成都科龙化工试剂厂，20150402)；丙基硫嘧啶(上海复星朝晖药业有限公司，141105)；丙二醇(天津市大茂化学试剂厂，20141128)；脱氧胆酸钠(上海Solarbio公司，20140611)；磁力搅拌器(上海KEEZO公司，KMS-181E)；全自动生化仪(美国Beckman公司，AU5800)；酶标仪(美国Thermo公司，Multiskan FC)。1.3蜂胶的纯化实验

粗制蜂胶经冷冻后粉碎，用10倍量的75%乙醇搅拌提取24 h，过滤，滤液在-20 ℃冷冻10 h，300目滤布过滤除蜡，在-10 ℃重复3次冷冻除蜡工艺，然后加温至60 ℃，加适量活化了的活性炭搅拌1 h脱铅，真空浓缩脱水之后进行冷却。得到的精制蜂胶含48%的蜂胶提取物，以及15%的黄酮，符合2009年《蜂胶国家标准》(标准编号为GB/T24283-2009)。使用时以生理盐水10倍溶解。

1.4高脂乳液的制备

烧杯中放入20 g猪油，用磁力搅拌器进行加热搅拌，升温至100 ℃，投入胆固醇8 g，完全溶解后滴入吐温-80 20 ml以及丙基硫嘧啶0.6 g，搅拌均匀呈油状；另一烧杯中放入丙二醇20 ml、蒸馏水130 ml，加热至60 ℃，投入脱氧胆酸钠1.2 g，搅拌均匀呈水相。冷却后将水相加入油相，搅拌混匀制成高脂乳液。其中猪油含量10%、胆固醇含量4%、胆酸钠含量0.6%、丙硫氧嘧啶含量0.3%。

1.5脂肪肝大鼠模型的建立及治疗

大鼠随机分正常组、模型组、易善复组(250 mg/kg)、蜂胶高剂量组(250 mg/kg)、蜂胶低剂量组(125 mg/kg)，每组各10只。每日下午除正常组以外的其余大鼠都要喂食高脂乳液(1 ml/100 g)喂药1 h后再对其喂食酒精含量为56%的酒溶液(1 ml/100 g)；另除正常组外，其余各组大鼠隔天腹腔注射10%的CCl4菜籽油溶液(0.08 ml/100 g)，正常组以等容积生理盐水注射于相同部位[7]。每日上午大鼠进行灌胃给药，周期为18 d。正常组和模型组以羧甲基纤维素钠混悬液灌胃，给药体积为1 ml/100 g；易善复组给药剂量为250 mg/kg，给药体积为1 ml/100 g；蜂胶高剂量组给药剂量为250 mg/kg，给药体积为1 ml/100 g；蜂胶低剂量组给药剂量为125 mg/kg，给药体积为1 ml/100 g。

1.6血清生化指标检测

末次给药后大鼠禁食16 h，称体重，股动脉取血，Beckman AU5800全自动生化仪对AST、ALT、TG、TC、FFA水平进行检测，试剂均购自美国Beckman公司。AST和ALT的检测方法为连续检测法；TG、TC和FFA的检测方法为酶法。

1.7血清炎症因子水平检测

Thermo酶标仪检测IL-6、IL-8、TNF-α水平，试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司。操作方法：准备试剂、样品和标准品→加入准备好的样品和标准品，37 ℃反应30 min→洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃反应30 min→洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃显色10 min→加入终止液→15 min之内450 nm测量OD值→计算。

摘除大鼠肝脏，称重，计算肝脏器系数，肝脏器系数=肝质量/体质量×100%，截取一部分肝左叶用10%甲醛固定，HE染色观察。

1.8统计学分析

用SPSS18.0软件进行，正态计量资料以均数±标准差表示，偏态数据经对数转换后再行分析。利用单因素方差分析法进行组别之间的对比，如果方差齐则利用LSD-t检验法进行组别之间的对比，如果方差不齐则利用Tamhane’s T2检验法进行两两对比。所有结果以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠一般情况

正常组大鼠饮食正常、体重增加、动作敏捷，其余各组在造模后逐渐出现不同程度的饮食减少、体重下降、不喜活动等现象。大多数大鼠在进行酒精喂食之后出现行走困难、动作迟钝、精神不振等症状。在造模末期，大鼠偶见醉酒表现，开始对酒精产生耐受。

2.2生化指标变化

相较于正常组，模型组血清TG、ALT、TC、AST、FFA明显增加(P<0.05)；相较于模型组，蜂胶高剂量和易善复能组的大鼠血样各项指标得到明显改善(P<0.05)；相较于易善复组，除FFA外其他指标蜂胶高剂量组并未出现明显差异(P>0.05，见表1)，这提示两组之间具有相同的治疗效果。

表1各组大鼠血清AST、ALT、TG、TC、FFA测定比较(n=10)

Table 1Comparison of serum AST, ALT, TG, TC and FFA among five groups(n=10)

组别 ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FFA(mmol/L)正常组93.9±11.3164.6±8.91.48±0.331.87±0.450.81±0.24模型组145.4±19.3#172.2±15.43.56±1.22#2.93±2.51#2.02±1.03#易善复组112.9±20.4#*162.6±54.6*2.12±0.71#*2.08±1.48#*1.24±0.98#*蜂胶低剂量组125.0±36.8*▲164.1±42.22.94±1.28▲2.17±1.501.65±0.52*▲蜂胶高剂量组111.1±41.0*159.4±58.5*2.31±0.65*1.96±1.14*1.52±0.79*▲

与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与易善复组比较，▲P<0.05

2.3相关炎症因子改变

与模型组比较，蜂胶高剂量组和易善复组大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α水平的差异均有统计学意义(P<0.05)，其中蜂胶高剂量组降低IL-6、IL-8和TNF-α水平的效果优于易善复组(P<0.05，见表2)，接近正常组。

2.4大鼠肝质量及脏器系数变化

与正常组比较，模型组大鼠的肝质量及肝脏器系数显著增高(P<0.05)，表明模型组大鼠肝脏明显肿大，提示造模成功。相较于模型组，在肝脏器系数的抑制效果上来说，蜂胶高剂量组和易善复组两组大鼠具有明显的优势，并且这两个组之间没有明显的差异(P>0.05，见表3)。

表2各组大鼠IL-6,IL-8,TNF-α比较(n=10)

Table 2Comparison of IL-6,IL-8 and TNF-α among five groups(n=10)

组别 IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(ng/ml)正常组1.48±0.752.16±0.9234.48±10.33模型组2.75±0.82#4.21±1.54#52.56±4.25#易善复组2.02±0.96#*2.66±1.06*38.12±12.71*蜂胶低剂量组1.97±0.88*3.52±2.01▲41.94±13.28*蜂胶高剂量组1.81±0.69*▲3.23±1.25*▲32.31±14.65*▲

与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与易善复组比较，▲P<0.05

表3各组大鼠肝重及脏器系数测定比较(n=10)

Table 3Comparison of liver weight and liver organ coefficient among five groups(n=10)

组别体质量(g)肝质量(g)肝脏器系数正常组 300±3910.36±2.033.43±0.39模型组 225±33#11.62±1.74#5.19±0.57#易善复组230±3210.10±2.03*4.39±0.68*#蜂胶低剂量组222±2711.22±1.66▲5.07±0.67▲蜂胶高剂量组223±2810.76±2.034.73±0.73*

与正常组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与易善复

组比较，▲P<0.05

2.5大鼠肝脏病理改变

正常组大鼠的肝细胞是多角形的，圆形的细胞核处于细胞中央，胞质着色嗜酸性。以中央静脉为中心肝细胞呈现出放射形的整齐排列，并未发现较为严重的脂肪沉淀(见图1A)。模型组大鼠的肝细胞则发生了弥漫性的中度脂肪变性，在胞质中出现大小不一的脂肪空泡，在胞质的一侧出现了较大的空泡，细胞核的周围则密密麻麻的分布着众多小空泡，在汇管区能够辨识到炎性的细胞浸润，细胞出现水肿和坏死现象(见图1B)。易善复组大鼠的脂肪空泡明显变少，但是，在汇管区仍然能够观察到炎性的细胞浸润(见图1C)。蜂胶高剂量组和蜂胶低剂量组可见轻度的细胞水肿，脂肪空泡减少，汇管区未见明显的炎性细胞浸润(见图1D、1E)。

A.正常组　　　　　　B.模型组　　　　　C.易善复组　　　　D.蜂胶高剂量组　　　E.蜂胶低剂量组 图1　大鼠肝脏病理学改变 (HE,×200)Figure 1　Pathological changes of liver in rats in different groups (HE,×200)

3　讨论

脂肪肝是指由多病因诱发的肝细胞脂肪过量沉积或者血脂的代谢功能出现异常等一系列的病变[8]。脂肪肝是引发动脉硬化、冠心病以及脑溢血等疾病的重要因素，其治疗以防治结合最为重要[9]。到目前为止，尚无治疗脂肪肝的特效药，西医多用降脂药物来代替治疗。一些调脂药物虽然对脂肪肝治疗有效，但却存在潜在的肝毒性，会加重肝脏损伤[10]。因此，如果能够找到一种既有调脂功能又有保肝功能的药物，将会为广大的脂肪肝患者带来福音。

蜂胶中含有有机酸类、烯萜类化合物、黄酮、芳香挥发油等丰富的营养成分，具有广泛的生理和药理作用，能起到保护肝脏的效果，为一种防治脂肪肝的首选良药[11]。但目前国内外对蜂胶在脂肪肝中调节机制的相关报道较少。因此，本研究建立了复合型脂肪肝的动物模型，并用蜂胶提取物进行治疗。结果发现：蜂胶在降低血清TC、ALT、TG、AST指标以及肝细胞脂肪空泡方面具有明显效果，并且可以抑制FFA的产生，与此同时，实验还发现蜂胶在消炎方面也具有一定的功效，能够有效抑制血清中炎症因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的作用。蜂胶中有可能具有某种活性成分，能对已破坏的肝细胞膜进行生理性修复，减少氧激酶与脂质的过氧化，从而更好地降低了炎症反应。

近几年，相关领域的研究专家将更多的精力倾注于细胞因子与肝病的关联性研究上，在肝细胞脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化以及肝硬化的病史发展中，细胞因子起到了决定性的因素[12-15]。

肝脏在脂肪变性初次打击后，由于自然杀伤T细胞的耗尽，使具有抗炎作用的Th-2细胞因子相对不足，进而使肝脏长期处于炎症反应环境中，NF-κB被激活，多种炎症因子如TNF-α、IL-8、IL-6产生增加，使肝细胞氧化应激、凋亡，并引起大量炎症细胞浸润。当肝脏不能拮抗上述过程时，最终导致脂肪性肝炎的发生。在肝脏，TNF-α由枯否细胞分泌，是肝脏损害过程中出现最早的炎症因子，在单纯性脂肪肝进展为脂肪性肝炎中扮演着重要角色[16]。

IL-6参与肝脏炎症损害、肝脏脂肪氧化和三酰甘油的清除。而高胰岛素血症可以引起肝脏脂肪酸聚集，形成肝脂舫变性。临床上用抑制IL-6活性的方法，提高机体对胰岛素的敏感性，进而防治脂肪肝的发生发展[17]。Yamaguchi等[18]用托珠单抗(Tocilizumab，IL-6受体的特异性抗体)干预脂肪肝小鼠，发现肝IL-6信号的严重抑制可能促进脂肪肝的进展。Kroy等[19]研究发现，IL-6/糖蛋白130信号传导缺陷的小鼠更易发生肝脂肪变性及损伤，促进脂肪肝的进展。

目前有关 IL-8在NAFLD中作用及其可能机制的研究较少[20]。肝脏脂肪变性可使IL-8产生增加，IL-8活化并趋化中性粒细胞，参与肝细胞的炎症损伤[17]。此外，FFA与炎症因子的相互调节在脂肪肝中也有非常重要的意义[21]，当发生脂肪肝病变时，血样检测往往会呈现出血清FFA指标上升的现象。

脂肪肝的发病机制在国际上一直存在较多的争议，炎症因子在其中所占的比例尚不完全清楚。此次试验表明，虽然蜂胶在抑制炎症因子(FFA、IL-6、IL-8、TNF-α)的影响上具有一定的功效，改善肝脏的炎性损伤和脂肪变性程度，有助于肝细胞的结构和功能恢复正常，但蜂胶中具体哪些活性成分起到主要作用，控制了炎症因子是否就可以预防脂肪肝的发生等问题还有待大规模的实验研究。

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Research on efficacy of propolis in rats with fatty liver and its mechanism

WANG Yao1，YANG Biao2，LI Zhuo1*

(1DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofOrthopaedics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:Lizhuo721@163.com)

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of prololis on fatty liver in rats and its mechanism.MethodsFifty rats were randomly divided into normal group, model group, polyene phosphatidylcholine group, high dose of propolis group, low dose of propolis group(n=10 in each group). The fatty liver model was induced by feeding high fat emulsion and 56% alcohol and injecting carbon tetrachloride in abdominal cavity. After the last administration and fasting for 16 h, the blood was collected from the femoral artery to detect the level of aspertate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), triglyceride(TG), cholesterol(TC),free fatty acids(FFA), interleukin-6(IL-6), interleukin-8(IL-8) and tumor necrosis factor α(TNF-α). The liver was removed to calculate the liver organ coefficient and observe the pathological changes.ResultsThe fatty liver rat model was established successfully. Compared with model group, the blood levels of AST, ALT, TG, TC, FFA in high dose group reduced significantly(P<0.05).The effect was better in high dose group than in low dose group, but close to that in polyene phosphatidylcholine group. Compared with model group, the blood levels of IL-6, IL-8 and TNF-α in high dose group decreased significantly(P<0.05). The liver organ coefficient in high dose group was lower than in model group(P<0.05). The edema and necrosis in hepatic cells were rare in high dose group, and the fat vacuoles decreased.ConclusionPropolis has obvious therapeutic effect on fatty liver in rats, which may be related to the changes of serum levels of inflammatory factors.

propolis;fatty liver;inflammatory factor;high fat emulsion;rats

陕西省教育厅专项科研计划资助项目(2010JK803)

王瑶，女，1984-04生，硕士，主管技师，讲师，E-mail：95244556@qq.com

2016-05-29

R575

A

1007-6611(2016)08-0693-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.004