TLR4在晚发型新生儿败血症中的意义

周　琴　张　勤　周素芽.浙江省人民医院儿科，浙江杭州　3004；.杭州市儿童医院新生儿科，浙江杭州　30006

TLR4在晚发型新生儿败血症中的意义

周琴1张勤1周素芽2
1.浙江省人民医院儿科，浙江杭州310014；2.杭州市儿童医院新生儿科，浙江杭州310006

目的探讨Toll样受体4（TLR4）对晚发型新生儿败血症诊断的临床意义。方法选取2011年8月～2014年11月我院收治的血培养阳性的新生儿38例作为败血症组，根据感染病原体将其分为革兰阳性菌感染组（G+组）23例，革兰阴性菌感染组（G-组）15例，另选取我院同期收治的无感染性疾病的新生儿20例作为对照组，采集各组患儿外周血，应用密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，采用RT-PCR法检测TLR4 mRNA表达水平，免疫投射比浊法检测血清CRP水平。比较组间各指标的差异，并分析两者的相关性。结果 G+组与G-组TLR4 mRNA及CRP水平与对照组相比均明显升高（P<0.01）；CRP在G+组与G-组两组间差异无统计学意义（P>0.05）；G-组TLR4 mRNA的表达明显高于G+组（P<0.05）。TLR4与CRP呈正相关（r=0.749，P＜0.01）。结论TLR4可以作为诊断晚发型新生儿败血症的有效指标，尤其对于识别革兰阴性菌感染更有意义。

Toll样受体4；C反应蛋白；新生儿；败血症

[Abstract]Objective To investigate the clinical significance of toll-like receptor 4(TLR4)in the diagnosis of late-onset neonatal septicemia.Methods A total of 38 newborns with positive blood culture who were admitted from August 2011 to November 2014 were selected as the septicemia group.According to the infection pathogens,the newborns were divided into gram positive bacteria infection group(G+)with 23 cases,gram negative bacteria infection group(G-)with 15 cases and 20 newborns without infectious diseases from the same period of time were selected as the control group. The peripheral blood of the newborns was collected and peripheral blood mononuclear cells were isolated with the density gradient centrifugation.The expression level of TLR4 mRNA was detected with RT-PCR method and serum CRP level was detected with immunity transmission turbidity.Compare the differences of each index of the two groups and analyze the correlation of the two groups.Results G+group and G-group both had significant higher TLR4 mRNA and CRP level compared with that of the control group(P<0.05);the difference of CRP level of the G+group and G-group had no statistical significance(P>0.05);the TLR4 mRNA level of G-group was significantly higher than that of the G+group(P<0.05).TLR4 and CRP had positive correlation(r=0.749,P<0.01).Conclusion TLR4 can be taken as the effective index in the diagnosis of late-onset neonatal septicemia,especially for the identification of G+infection.

[Key words]Toll-like receptor 4;C-reactive protein;Newborn;Septicemia

新生儿免疫系统未成熟，免疫功能较差，极易发生细菌感染，发生感染后很难局限而导致败血症[1]。新生儿败血症早期临床表现不典型，病情发展迅速，是新生儿死亡的重要原因[2]，因此选取敏感性、特异性高的指标对新生儿败血症的早期诊断具有非常重要的意义。虽然C反应蛋白（C-reaction protein，CRP）是新生儿败血症经典的指标之一，但其仍缺乏一定的特异性[3]。Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，可与病原识别模式分子结合，通过介导细胞信号转导致炎症因子释放，从而识别病原微生物、启动炎症应答[4]。为了探讨TLR4与 CRP在晚发型新生儿败血症中的表达及其临床价值，本研究选取了我院收治的患败血症新生儿进行检测，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2011年8月～2014年11月浙江省人民医院新生儿科收治的血培养阳性的新生儿38例作为败血症组，所有患儿均于出生7 d后发病，且符合新生儿败血症相关诊断标准[5]。38例患儿中，男21例，女17例，胎龄37～42周，日龄8～28 d，平均（19.2±5.4）d。根据血培养结果将其分为革兰阳性菌组（G+组）23例，其中表皮葡萄球菌13例，溶血性葡萄球菌7例，金黄色葡萄球菌3例；革兰阴性菌组（G-组）15例，其中大肠埃希菌 6例，肺炎克雷伯杆菌5例，鲍曼不动杆菌4例。另选取我院同期收治的无感染性疾病的新生儿20例作为对照组，其中男12例，女8例，日龄8～28 d，平均（20.1±5.7）d。各组之间在出生体重、日龄以及胎龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2实验仪器与试剂

TRI Reagent总RNA提取试剂盒（TR-118）为MRI公司产品，RT-PCR试剂盒（DRR023A）购自TaKaRa公司。Ficoll分离液（CL5020）购自上海普飞生物技术有限公司。RT-PCR仪为Biometra Germen公司产品。CRP检测采用迈瑞公司BECKMAN生化仪。

1.3标本收集与处理

败血症组患儿使用抗生素前，于清晨空腹抽取2 mL静脉血，取0.5 mL用免疫投射比浊法检测CRP的水平；1.5 mL加入Ficoll分离液，采用密度梯度离心法以3500 rpm/min，时间20 min，分离外周血单个核细胞[6]。加入Trizol提取总RNA，随后放于-70℃冻存。对照组患儿于空腹采集2 mL外周静脉血，标本处理同上。

1.4RT-PCR法检测TLR4 mRNA

逆转录反应按TaKaRa公司试剂盒说明书进行。用β-actin作为内参照，引物序列及反应条件：①βactin：5’-CTACAATGCTGCGT GTGG-3’，5’-ATGGC TACGTACATGGCTGG-3’，产物长度138 bp；②TLR4：5’-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3，5’-ATGGGT TTTAGGCGCAGAGTTT-3’；94℃3 min后，94℃30 s，59℃30 s，72℃1 min，循环32次，72℃延伸5 min终止，产物长度356 bp。用SmartView分析产物光密度值，以TLR4条带与β-actin的光密度值比，作为其mRNA水平的指标。

1.5统计学处理

采用SPSS13.0统计学软件，计量资料以（x±s）表示，G+组与G-组和对照组比较采用单因素方差分析，G+组与G-组比较用LSD检验，TLR4与CRP的相关性采用Pearson等级相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组新生儿TLR4 mRNA、CRP水平检测水平比较

与对照组比较，G+组与G-组新生儿TLR4 mRNA 及CRP水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；CRP在G+组[（46.92±18.69）mg/L]与G-组[（55.70± 26.97）mg/L]两组间差异无统计学意义（P>0.05）；TLR4 mRNA在G-组（1.94±0.23）的表达明显高于 G+组（1.78±0.26），差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2TLR4与CRP的相关性分析

TLR4 mRNA的含量与CRP的水平呈正相关（r= 0.749，P＜0.01）。

表1　三组新生儿TLR4 mRNA与CRP水平比较（x±s）

3　讨论

新生儿由于免疫系统发育不完善，特异性与非特异性免疫反应均较差，因此对感染普遍易感，且感染后不能有效清除体内病原体，容易扩散形成败血症[7]。同时新生儿败血症早期缺乏典型的临床表现，多为不哭、不动、嗜睡、反应力低下等，因此不易被及时诊断[8]。血培养是确诊败血症的金标准，但阳性率低，且至少需要48 h才能得到结果，不能进行早期诊断。因此，迫切需要寻找一种准确而快速诊断新生儿败血症的实验室指标。

CRP是一种急性时相反应蛋白，主要是由肝脏合成，其含量在机体炎症反应或组织损伤时明显增加，是非特异性炎性指标[9]。CRP可在新生儿感染后在6 h内迅速增加，达峰于48 h，半衰期约19 h，高峰可为正常值的100~1000倍[10]。CRP可在败血症的过程中持续升高，但其亦可在肿瘤、其他免疫性疾病中升高，故缺乏一定的特异性[11]。且我们实验发现，CRP的表达在G+与G-细菌感染之间无差异，这对于我们临床在区分可能的病原菌感染及选择抗生素时，带来了一定的困难。我们实验还发现在CRP上升的同时，TLR4的表达也逐渐增加，两者呈现明显的正相关。那么在败血症的新生儿患儿中检测TLR4是否可以作为CRP的补充指标呢？

TLRs最早由果蝇体内分离得到，是一类与免疫系统识别微生物有关的细胞膜跨膜受体，是机体抵抗病原体的屏障，在非特异性免疫中发挥重要作用[12]。当细胞外病原体相关分子模式配体与 TLRs结合后，又可激活特异性免疫[13]。TLR4是首个在人类细胞表面发现的TLR，主要表达于单核巨噬细胞膜上，可识别革兰阴性菌的细胞壁成分：如脂多糖、脂磷壁酸等，激活后可产生炎性细胞因子及效应因子，进一步活化放大炎症反应，从而有效清除病原体[14，15]。王琳等[16]认为，新生儿尤其早产儿TLR表达低下，可能是新生儿免疫功能差、易患新生儿败血症等感染性疾病的原因之一。Kollmann等[17]发现在晚发型新生儿败血症患儿体内，TLR通过识别细菌表面的脂多糖成分活化单核巨噬细胞系统，从而激活丝裂原蛋白活化激酶，发挥清除细菌的作用。Redondo等[18]在血培养阳性的败血症新生儿的单核细胞中发现TLR4的表达明显升高，且在革兰阴性菌组TLR4的升高更加明显，但TLR2的表达水平与对照组相比却无明显上升。张金萍等[19]研究发现，新生儿败血症组TLR2与TLR4均明显增高，且TLR2在革兰阳性菌感染时升高明显，而革兰阴性菌感染时TLR4显著增高。

我们的实验结果发现，革兰阴性菌感染组TLR4 mRNA的表达明显高于革兰阳性菌感染组，这一结果与文献报道相符[20]，其机制可能与TLR4能识别脂多糖等革兰阴性菌细胞壁成分相关。这一结果也提示，在可疑新生儿败血症的患儿早期检测CRP的同时，测定TLR4的水平，不仅能作为判断败血症感染的指标，而且TLR4的明显升高更能提示革兰阴性菌感染的可能性，为在取得血培养结果之前经验性选择抗生素提供有力的实验保障。

综上所述，TLR4可以作为诊断晚发型新生儿败血症的有效指标，尤其对于识别革兰氏阴性菌感染更有意义。但我们仍需研究发生新生儿败血症时TLR4的下游信号通路转导途径，进一步研究是否可以通过抑制其活化，来达到控制炎症瀑布反应的产生，从而为临床治疗新生儿败血症带来新的思路和理论依据。

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Significance of TLR4 in the late-onset neonatal septicemia

ZHOU Qin1ZHANG Qin1ZHOU Suya2
1.Department of Pediatrics,Zhejiang People's Hospital,Hangzhou310014,China;2.Department of Neonatology, Hangzhou Children's Hospital,Hangzhou310006,China

R722.1

A

1673-9701（2016）12-0011-03

浙江省中医药科学研究基金计划（2011ZB014）

2016-01-04）