TLR2信号通路对急性冠状动脉综合征患者冠脉病变的影响

肖兴花 刘燕 刘清伟 刘成华

TLR2信号通路对急性冠状动脉综合征患者冠脉病变的影响

肖兴花 刘燕 刘清伟 刘成华

目的 探讨TLR2信号通路激活对急性冠脉综合征患者冠脉病变的影响。方法 选择2015年1～12月在临沂市沂水中心医院行冠状动脉造影确诊的180例急性冠状动脉综合征患者为研究组；对照组是因胸痛入院但经冠状动脉造影排除冠状动脉粥样硬化，并除外其他疾病的患者50例。用流式细胞仪检测单核细胞表面TLR2蛋白表达，ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平，免疫浊度法测定 hs-CRP。冠状动脉造影评价：冠状动脉造影评分采用 Gensini评分标准，并根据Gensini评分将患者分为低Gensini组（n=44）、中Gensini组（n=95）及高 Gensini组（n=41）组，比较各组之间 TLR2表达比例，TNF-α、IL-6及 hsCRP 水平。术后电话随访1个月、3个月、6个月不良心血管事件的发生情况。结果 急性冠脉综合征患者单核细胞TLR2表达比例，TNF-α、IL-6及hs-CRP水平均较对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。多支病变组和两支病变组外周血单核细胞表面TLR2表达水平及TNF-α、IL-6和hs-CRP高于单支病变组，差异有统计学意义（P＜0.05）。Gensini评分高者，单核细胞TLR2表达比例高［（90.33±12.46）%］，TLR2水平与Gensini评分呈正相关（r=0.297，P=0.009），TNF-α、IL-6、hs-CRP 与 Gensini评分呈正相关（r=0.396，P=0.019；r=0.113，P=0.024；r=0.201，P=0.005）。高Gensini组比低Gensini组不良心血管事件比例高（10.52%比4.76%），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 急性冠脉综合征患者单核细胞TLR2蛋白表达水平能预测冠脉病变严重性，TLR2信号通路激活对冠心病风险有预测价值。

急性冠状动脉综合征；Toll样受体2；冠状动脉狭窄；危险因素

Toll2样受体（Toll-like receptor 2，TLR2）是一种识别病原相关分子模式（PAMPs）的模式识别受体，具有促进炎症反应及诱导获得性免疫的作用。炎症和免疫学机制直接参与动脉粥样斑块的破裂及血管腔急性堵塞而导致急性冠脉综合征的发生和发展。本研究通过观察急性冠状动脉综合征患者外周血单核细胞表面TLR2水平与冠状动脉病变程度的相关性，进一步探讨TLR2信号通路水平对急性冠脉综合征患者风险的预测价值。

1 对象与方法

1.1 对象及分组 选择2015年1～12月在临沂市沂水中心医院行冠状动脉造影确诊的180例急性冠脉综合征患者为研究组；对照组是因胸痛经冠状动脉造影排除冠状动脉粥样硬化，运动平板试验、心肌标志物阴性，并除外其他疾病的患者50例。急性冠脉综合征的诊断按美国学院心脏病学会/美国心脏病协会（ACC/AHA）制定的诊断标准（2011年）。研究组所有患者均有阵发性或持续性心前区疼痛，并经冠状动脉造影或心电图、holter、肌酸激酶同工酶、心肌肌钙蛋白等检查确诊。患者入院后采集病史，如患者年龄、体质指数、性别、吸烟史、高血压史，并行常规检查，检测患者血常规、血脂、空腹血糖、射血分数等。排除标准:各种急慢性炎症、心肌桥、冠状动脉畸形、心肌病、心瓣膜病或先天性心脏病、心力衰竭、呼吸系统疾病等。本研究经临沂市沂水中心医院医学伦理委员会批准，所有入选研究者均在知情同意下签署知情同意书。

1.2 方法 急性心肌梗死患者发病6 h内采集肘静脉血5 ml，其余入选患者于住院次日清晨空腹采集肘静脉血5 ml置于EDTA抗凝管。

1.2.1 TLR2蛋白检测 抗凝全血100 μl，加入红细胞裂解液 70 μl，避光静置 10～15 min，1500 r/min 离心 3～5 min，PBS 液振荡洗涤 2～3 次，加入 20 μl PE标记鼠抗人TLR4单抗，混匀后室温避光孵育20～30 min后PBS液振洗1～2次，将经荧光染色的单核细胞离心沉淀，再加入固定液1 ml混匀，于4℃保存。标本收集齐后，离心弃去保存液，所得细胞以PBS调整细胞密度为2×109/L，上流式细胞仪检测。用流式细胞仪检测单核细胞表面TLR2蛋白表达，每管获取10 000个细胞。

1.2.2 血浆肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）水平检测 静脉血2 ml，以2000 r/min离心10 min，收集上清液，－20℃保存备用。ELISA法检测血清TNF-α、IL-6水平，实验步骤严格按照ELISA试剂盒操作程序进行。采用全自动生化仪用免疫浊度法测定hs-CRP，利用hs-CRP定量检测试剂盒，实验步骤严格按照操作程序进行。

1.2.3 冠状动脉造影评价 冠状动脉造影评分采用Gensini评分标准，将病变血管分为左主干、左前降支、回旋支和右冠状动脉。对每支血管病变程度进行定量评定：无狭窄计0分，狭窄25%计1分，26%～50%计 2分，51%～75%计 4分，76%～90%计 8分，91%～99%计16分，100%计32分。不同节段冠状动脉乘以相应系数：左主干病变×5.0；左前降支近段×2.5，中段×1.5，远段×1.0；第一对角支×1.0；第二对角支×0.5；左回旋支近段×2.5，中段×1.5，远段和后降支均×1.0，后侧支×0.5；右冠近中远段和后降支均×1.0，最终积分为各分支积分之和。

1.2.4 随访 术后1个月、3个月、6个月电话随访不良心血管事件的发生情况，回访内容包括心肌梗死、再次入院、心源性死亡、非计划性靶血管再次血运重建。

1.3 统计学方法 本课题研究数据采用SPSS 17.0软件包进行统计学处理。所有正态分布的计量资料用±s表示，采用t检验或单因素方差分析，组间采用LSD检验；正态分布资料采用Pearson相关分析。计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验；非正态分布资料采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料 两组患者的一般情况如年龄、体质指数、性别、吸烟史、高血压、血脂、空腹血糖、射血分数等比较均未见无统计学差异，见表1。

2.2 急性冠脉综合征患者单核细胞TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP水平比较 研究发现，急性冠脉综合征患者单核细胞TLR2表达水平较对照组明显升高，两者差异有统计学意义。急性冠脉综合征患者血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP水平较正常对照组明显升高，两者差异有统计学意义。见表2。

表1 两组患者临床基本资料比较［±s，例数及百分率（%）］

表1 两组患者临床基本资料比较［±s，例数及百分率（%）］

注：ACS：急性冠脉综合征；BMI：体重指数；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白

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表2 两组患者单核细胞TLR2表达水平及血浆TNF-α、IL-6、hs-CRP 水平比较（±s）

表2 两组患者单核细胞TLR2表达水平及血浆TNF-α、IL-6、hs-CRP 水平比较（±s）

注：ACS：急性冠脉综合征；TLR2：Toll2 样受体；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白介素-6；hs-CRP：高敏 C 反应蛋白。与对照组比较，aP＜0.05

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2.3 急性冠脉综合征患者冠状动脉病变支数与单核细胞TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP水平的关系 多支病变组TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP与两支病变组和单支病变组之间差异有统计学意义（P＜0.05）；两支病变组和多支病变组TLR2表达水平及血浆 TNF-α、hs-CRP水平与单支病变组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表3 不同冠状动脉病变支数患者TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP 水平比较（±s）

表3 不同冠状动脉病变支数患者TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP 水平比较（±s）

注：TLR2：Toll2 样受体；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白介素-6；hs-CRP：高敏C反应蛋白。与单支病变组比较，aP＜0.05；与双支病变组比较，bP＜0.05

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2.4 单核细胞TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP水平与冠状动脉病变程度的相关性 研究发现，不同冠状动脉Gensini评分组间TLR2表达水平及血浆TNF-α、IL-6、hs-CRP水平水平差异具有统计学意义。以冠状动脉造影Gensini评分评价冠状动脉病情严重程度，将患者分为低Gensini组（1≤Gensini评分＜20）、Gensini组（20≤Gensini评分＜40）及高 Gensini组（Gensini评分≥40），将各组分别与 TLR2、TNF-α、IL-6、hs-CRP 水平进行相关性分析。结果显示，TLR2水平与Gensini评分呈正相关（r=0.297，P=0.009），TNF-α、IL-6、hs-CRP与 Gensini评分呈正相关 （r=0.396，P=0.019；r=0.113，P=0.024；r=0.201，P=0.005）。见表 4。

2.5 终点事件比较 电话随访不良心血管事件（心肌梗死、再次入院、心源性死亡、非计划性靶血管再次血运重建）的发生情况，共有172例患者接受回访，8例失访。通过回访发现，Gensini评分≥40分时，患者不良心血管事件较组1≤Gensini评分＜20分组、20分≤Gensini评分＜40分组明显升高，差异有统计学意义。

3 讨论

目前对于急性冠脉综合征早期诊断、风险预测、治疗方案的选择以及预后的判断成为关注的热点。大量的实验研究及临床研究证实炎性因子在其中的作用以及作用的相关机制[1-3]。研究显示，急性冠状动脉综合征患者体内IL-6、hs-CRP表达均较健康人群明显增高，进一步证明急性冠脉综合征患者体内炎性程度较高，提示其斑块具有不稳定性，容易发生斑块破裂、血栓形成，预示患者发生心血管事件的风险显著增高[4,5]。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）是一种识别病原相关分子模式（PAMPs）的模式识别受体。近些年大量证据表明TLR2在心血管疾病发生发展中发挥重要作用。在心血管疾病中，当组织发生损伤时可激活TLR2信号通路，并可通过激活NF-κB信号通路诱发炎症因子 TNF-α、IL-6等的表达[6]。Gurses等[7]发现，急性冠脉综合征患者血小板TLR2表达水平较对照组明显增加。Shishido等[8]发现，TLR2敲除小鼠心肌梗死模型中的非梗死区心肌纤维化程度、梗死区白细胞浸润，左室舒张末期内径较对照组明显减小，而生存率、射血分数较对照组明显增高。在心肌缺血再灌注模型中发现，TLR2敲除小鼠心梗面积较对照组明显减小，心脏功能改善，并能降低心肌缺血再灌注损伤后小鼠的死亡率和恶性心律失常的发生率[9,10]。最近研究发现，急性心肌梗死及心源性休克患者TLR2受体单核细胞上表达较对照组明显升高，并发现TLR2受体激活对心肌缺血性损伤有重要作用[11]。

表4 不同冠状动脉病变 Gensini评分组间TNF-α、IL-6、hs-CRP水平比较（±s）

表4 不同冠状动脉病变 Gensini评分组间TNF-α、IL-6、hs-CRP水平比较（±s）

注：TLR2：Toll2 样受体；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白介素-6；hs-CRP：高敏 C 反应蛋白。与 1≤Gensini评分＜20 组比较，aP＜0.05；与 20≤Gensini评分＜40组比较，bP＜0.05

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近期研究发现，急性心肌梗死患者TLR2的表达激活，并能激活患者炎症因子的表达[12]。本研究发现，急性冠脉综合征患者单核细胞TLR2表达水平较对照组明显升高，两者差异有统计学意义。急性冠脉综合征患者血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP水平较正常对照组明显升高，两者差异有统计学意义。Elsenberg等[13]发现，稳定型心绞痛患者激活TLR2信号通路能激活炎症因子的表达。通过以上研究发现，急性冠脉综合征患者TLR2通路激活可能激活炎症因子的表达。进一步讨论患者冠脉病变情况与TLR2表达情况，我们发现，多支病变组与两支病变组TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP水平较单支病变组明显升高（P＜0.05）。不同冠状动脉Gensini评分组间TLR2表达水平及血浆 TNF-α、IL-6、hs-CRP 水平存在差异（P＜0.05），TLR2信号通路激活水平与Gensini评分呈正相关。电话随访不良心血管事件6个月，主要心血管事件包括心肌梗死、再次入院、心源性死亡、非计划性靶血管再次血运重建等的发生情况，通过回访发现，Gensini评分≥40分组患者不良心血管事件较1≤Gensini评分＜20分组、20≤Gensini评分组明显增加（P＜0.05），Gensini评分越高患者主要心血管事件发病率越高。

综上所述，本研究发现急性冠脉综合征患者TLR2信号通路的表达增加并引起炎症因子TNF-α、IL-6、hs-CRP等增加。研究进一步发现，患者TLR2蛋白表达水平与冠状动脉病变严重程度呈正相关，TLR2及 TNF-α、IL-6、hs-CRP 表达增加预示不良心血管事件发生较多。

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Effect of Toll-like receptor 2 signaling on the coronary artery stenosis in patients with acute coronary syndromes

XIAO Xing-hua＊，LIU Yan，LIU Qing-wei，et al.＊Department of Cardiology，Yishui Centrul Hospital of Linyi，Linyi 276400，China

LIU Cheng-hua，E-mail：lchxxhlx@163.com

Objective To analyze the relationship between the level of Toll-like receptor 2 signaling and the clinical manifestations of ACS and the severity of angiographic lesion.Methods A total of 180 ACS patients were scheduled to undergo elective cardiac catheterization for suspected coronary artery disease according to clinical manifestations of coronary heart disease from January to December 2015.Another 50 patients who were excluded for ACS by coronary angiography were enrolled as non ACS control group.Gensini scores of coronary angiographicstenosis were calculated in all patients.All subjects were divided into 3 groups：high Gensini group（n=44），medium Gensini group（n=95）and low Gensini group（n=41）.Expression of TLR2 was detected by flow cytometric analysis.Levels of serum TNF-α，IL-6 and hs-CRP were measured，compared and analyzed in all groups.The occurrence of major adverse cardiac events were observed at 1-month，3-month and 6-month later.Results TLR2，TNF-α，IL-6，hs-CRP levels of patients with ACS group were apparently higher than those in the control group（P＜0.01）.TLR2，TNF-α，IL-6，hs-CRP levels in muti-vessel ACS group were higher than those in single-vessel ACS group and double-vessel ACS group（P＜0.05）.TLR2，TNF-α，IL-6，hs-CRP in double-vessel ACS group were higher than that in single-vessel ACS group（P＜0.05）.The levels of TLR2 showed positive correlation to Gensini score（r=0.297，P=0.009）.The levels of TNF-α，IL-6 and hs-CRP showed positive correlation to Gensini score（r=0.396，P=0.019，r=0.113，P=0.024，r=0.201，P=0.005）.Composite primary endpoint events in low Gensini score group decreased as compared with high Gensini score group（4.76%vs 10.52%，P＜0.05）.Conclusion Increased Toll-like receptor 2 signaling level may be related with occurrence of acute coronary syndrome，and its detection possesses certain application value for early diagnosis and treatment of acute coronary syndrome.

Acute coronary syndrome；Toll-like receptor 2；Coronary stenosis；Risk factors

临沂市科技发展计划项目（项目编号：201515086）

276400 山东省临沂市，临沂市沂水中心医院心内科（肖兴花、刘清伟、刘成华）；沂水县妇幼保健院（刘燕）

刘成华，E-mail：lchxxhlx@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.12.011

R543.3

A

1672-5301（2016）12-1093-05

2016-04-16）