急性心肌梗死患者循环miR-208b-3p诊断价值的研究

张一凡 王丽君 党凤强 齐丽梅 徐越 孙晶 郎明非 谢莲娜

急性心肌梗死患者循环miR-208b-3p诊断价值的研究

张一凡 王丽君 党凤强 齐丽梅 徐越 孙晶 郎明非 谢莲娜

目的 探讨急性心肌梗死患者循环miR-208b-3p与健康人的表达是否具有差异，及其在不同亚组中的诊断价值。方法 收集140例大连大学附属中山医院心血管内科2012年5月至2014年8月确诊为急性心肌梗死（AMI）患者入院即刻血浆样本和19例健康人（HC）血浆样本。特异茎环反转录实时定量PCR（qRT-PCR）检测样本miR-208b-3p的表达水平，并与超敏肌钙蛋白I（hs-TnI）和肌酸激酶-同工酶（CKMB）进行对比分析。qRT-PCR检测ST段抬高型心肌梗死（STEMI）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者血浆miR-208b-3p表达水平，ROC曲线评估诊断价值。结果 AMI组和HC组血浆miR-208b-3p的表达量分别为 43.86±7.50和 2.05±0.62，差异具有统计学意义（P＜0.05）；miR-208b-3p与 CK-MB 呈明显正相关（r=0.546，P＜0.01），miR-208b-3p、CK-MB 和 hs-TnI ROC 曲线下面积（AUC）分别是 0.874（P＜0.01）、0.976（P＜0.01）和 0.971（P＜0.01）；STEMI亚组和 NSTEMI亚组血浆 miR-208b-3p 表达量分别为 55.04±10.44 和 21.01±7.13，差异具有统计学意义（P＜0.05），AUC 分别为 0.935（P＜0.01）和 0.749（P＜0.01）。结论 循环 miR-208b-3p可作为AMI患者的早期诊断标准，但不优于hs-TnI和CK-MB；循环miR-208b-3p对于STEMI亚组的诊断敏感度和特异度高于NSTEMI亚组。

急性心肌梗死；循环miRNAs；miR-208b；诊断

MiRNA是一种由 19～24个核苷酸（nt）组成的微小RNA片段，在细胞增殖、分化、凋亡和发育过程中发挥重要作用[1,2]。近年来研究发现，miRNA可稳定存在于人类外周血中，并在肿瘤、肌肉损伤、炎症等多种疾病的发生发展中发挥作用[3]，此外对心脏发育也发挥精细的调控作用[4]。但对AMI亚组循环miRNAs的研究较少。本研究采用qRT-PCR方法对ST段抬高型心肌梗死（STEMI）和非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）患者循环miR-208b-3p表达水平进行定量测定，了解不同人群的表达水平，探究其早期诊断AMI的可能性。

1 对象与方法

1.1 入选对象及分组 选择140例大连大学附属中山医院心血管内科2012年5月至2014年8月确诊为AMI的患者，其中STEMI组94例、NSTEMI组46例；HC组19例均为健康体检人群，无心电图异常表现及心血管疾病。所有入选者均经本院伦理委员会批准，并签署知情同意书。

AMI诊断标准参照最新版“心肌梗死全球统一定义”的AMI诊断标准[5]。入选患者排除标准：①合并急慢性感染的肝脏疾病；②急慢性肾脏疾病及其导致的肾功能不全；③血液系统疾病；④肿瘤性疾病；⑤肌肉损伤及严重的心功能不全等。另外要求采血前患者未使用抗凝剂，标本无明显溶血，EDTA管收集。

1.2 AMI患者血浆miRNA的检测

1.2.1 AMI患者血浆分离及储存 EDTA-K2抗凝管采集符合诊断标准的研究对象全血2～4 ml，所有入选患者标本均为急诊入院即刻采血，并在4 h内处理完毕。另外收集19例健康人血液标本作为对照。所有标本2000×g，4℃离心15 min，吸取上清血浆至新的EP管中，将血浆分装在两个1.5 ml EP管中，-80℃保存备用。

1.2.2 血浆总RNA提取 血浆标本置于冰上待完全融化。取250 μl血浆样本并与750 μl Trizol LS（Life Technologies，美国）充分混匀。室温孵化10 min后加入5 nM人工合成线虫miRNA-39-3p（celmiR-39-3p）5 μl，上下颠倒混匀，作为外参。然后向EP管中加入250 μl氯仿，剧烈震荡20 s，室温静置15 min后13 000×g，4℃离心15 min。此时可见管中液体分为三层，RNA只存在于上层清液中，小心吸取上层清液。每个样本加入20 mg/ml无酶Glycogen 0.5 μl混匀助沉，再加入 500 μl异丙醇混匀，置冰上孵化 10 min后，13 000×g，4 ℃离心 10 min。去除EP管上层悬液，仅留下RNA小球，加入1 ml配置好的无酶75%乙醇混匀，7500×g，4℃离心5 min。弃去上清，室温干燥10 min，加入20 μl DEPC水，吹打均匀，57℃水浴孵化10 min。

提取总RAN后，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性；NanoQuant酶标仪（瑞士TECAN集团公司）检测RNA纯度，RNA纯度=OD260/OD280，该比值应在1.8～2.0。按照反转录试剂盒（宝生物公司，大连）说明制备20 μl反应体系，使用东胜龙PCR仪ETC811（苏州东胜兴业科学仪器有限公司）进行反转录，反应条件：42 ℃，15 min；85 ℃，5 s。本试验采用特异颈环引物反转录法制备cDNA，miR-208b-3p（MIMAT0004960）反转录引物及qPCR上下游引物均由广州市锐博生物科技有限公司设计。提取的cDNA于-20℃保存备用。

1.2.3 血浆miRNA的检测 使用CFX Connect荧光定量PCR仪（BIO-RAD，美国）按照miRNA sqPCR扩增试剂盒（宝生物公司）说明书制备反应体系及qPCR检测，检测血浆miR-208b-3p表达量。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt方法计算血浆miR-208b-3p的相对表达量。

1.3 ACS患者临床生化指标检测 本试验所有患者临床生化指标均由我院检验科检测。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件和GraphPadPrism v6.0对数据进行分析和作图。定量资料用±s表示，两组数据服从正态分布行t检验，两组以上数据服从正态分布的行方差分析，对非正态分布的数据采用非参数检验；Pearson相关分析分析相关性；ROC曲线及曲线下面积（AUC）评估诊断准确性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般临床资料 AMI组与HC组相比，两组在年龄、性别、是否患有糖尿病、收缩压及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等方面未见统计学差异；而在是否吸烟、是否患有高血压、舒张压及超敏肌钙蛋白I（hs-TnI）等方面差异有统计学意义（P＜0.01）。STEMI组与NSTEMI组相比，两组仅在年龄、超敏肌钙蛋白I（hs-TnI）、总胆固醇及肌酸激酶-同工酶（CK-MB）方面差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

2.2 各组患者血浆miR-208b-3p表达水平变化心脏富集循环血浆miR-208b-3p在各组均可测得。AMI组患者血浆miR-208b-3p表达水平显著高于HC组，差异具有统计学意义（P＜0.05），AMI组和HC组血浆miR-208b-3p的表达量分别为43.86±7.50 和 2.05±0.62（图 1A）；此外，STEMI亚组血浆miR-208b-3p表达水平也显著高于NSTEMI亚组，差异具有统计学意义（P＜0.05），表达量分别为 55.04±10.44 和 21.01±7.13（图 1B）。

表1 各组研究对象一般临床资料比较［±s，例数及百分率（%）］

表1 各组研究对象一般临床资料比较［±s，例数及百分率（%）］

注：HC:健康对照；AMI：急性心肌梗死；NSTEMI：非ST段抬高性心肌梗死；STEMI：ST段抬高性心肌梗死；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；hs-TnI：超敏肌钙蛋白 I；CK-MB：肌酸激酶-同工酶；hs-CRP：超敏C反应蛋白；Cr：肌酐；ALT：丙氨酸转氨酶；NT-proBNP：B 型氨基端利钠肽原。与 HC 组相比，aP＜0.01，bP＜0.05；与 NSTEMI相比，cP＜0.05，dP＜0.01

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2.3 血浆miR-208b-3p表达水平与hs-TnI及CK-MB的关系 AMI组患者血浆miR-208b-3p表达水平与CK-MB水平呈正相关（图2）。Pearson相关性分析显示，miR-208b-3p与CK-MB呈明显正相关（r=0.546，P＜0.01）。ROC 曲线分析血浆miR-208b-3p与hs-TnI和CK-MB诊断准确性（图3），曲线下面积（AUC）分别是 0.874（95%CI 0.802～0.946，P ＜0.01）、0.971 （95%CI 0.940 ～1.001，P ＜0.01）和 0.976（95%CI 0.947～1.004，P＜0.01）。结果显示，miR-208b-3p的曲线下面积具有统计学意义，但均小于hs-TnI及CK-MB的曲线下面积。

2.4 AMI各亚组miR-208b-3p的诊断准确性 通过ROC曲线对NSTEMI亚组和STEMI亚组miR-208b-3p的诊断准确性进行评估，STEMI亚组和NSTEMI亚组的曲线下面积（AUC）分别为0.935（95%CI 0.877～0.992，P＜0.01） 和 0.749（95%CI 0.626～0.873，P＜0.01）。结果显示，NSTEMI亚组和STEMI亚组曲线下面积均具有统计学意义，但STEMI亚组曲线下面积大于NSTEMI亚组（图4）。

3 讨论

随着cTns在临床中被广泛应用，逐渐发现在AMI早期（＜4 h）用普通方法检测cTns时，血清cTns诊断不是很敏感[6]，且有研究显示，无心肌损伤的终末期肾病患者血浆中cTns含量也明显升高，导致假阳性的出现[7]；而高敏感度cTnT在慢性稳定型冠心病和部分健康人群中也会出现阳性情况，这也体现出hs-cTnI仍有一定局限性。

尽管有很多研究显示，心脏富集miRNA与心肌损伤有关[8-11]，但最近的一项研究指出，这些miRNA由心肌细胞释放[12]。其中miR-208被称为肌源性miRNA，在心肌组织中高表达，而在其他组织中基本不表达[13]，故也有心脏特异性miRNA之称。MiR-208是由2个成员构成的高度保守miRNA家族，为miR-208a和miR-208b，分别位于Myh6和Myh7基因[14]。

有研究指出，miR-208a和miR-208b在心脏中高表达[15]，其中90%的AMI患者血浆中可检测到升高，对应的在89%的健康人群中检测不到[16]。本试验结果显示，AMI组患者血浆miR-208b-3p较HC组明显升高，差异具有统计学意义（图1A），并通过相关性分析指出miR-208b-3p与CK-MB呈正相关。但ROC曲线及曲线下面积表明，虽然miR-208b-3p对AMI有一定的早期诊断敏感性和特异性，但与hs-TnI和CK-MB相比，miR-208b-3p的诊断价值并不优于hs-TnI和CK-MB。

以往的研究主要集中在AMI患者与不稳定心绞痛患者血浆miR-208b表达水平的对比，却很少对AMI患者不同亚组之间进行分析比较。本研究通过分析STEMI亚组患者和NSTEMI亚组患者血浆miR-208b-3p的表达水平，指出血浆miR-208b-3p在STEMI亚组的表达水平高于NSTEMI亚组，差异具有统计学意义（图1B）。并通过ROC曲线分析得出miR-280b-3p在STEMI亚组的诊断特异度和敏感度高于NSTEMI亚组。

本研究也有不足之处。首先样本含量较小，使本研究有一定的局限性；其次没有对稳定型心绞痛患者和心力衰竭患者进行综合分析，研究有待进一步深入。综上所述，还需大样本和规范化的研究对循环miRNAs是否可作为AMI早期的诊断标准做进一步分析。

图1 各组患者血浆miR-208b-3p的表达水平，以cel-miR-39-3p作为外参

图2 miR-208b-3p表达水平与CK-MB相关性分析

图3 ROC曲线评估血浆miR-208b-3p与hs-TnI和CK-MB诊断准确性

图4 ROC曲线评估STEMI亚组和NSTEMI亚组诊断准确性

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The diagnostic value of circulating miR-208b-3p in acute myocardial infarction

ZHANG Yi-fan＊，WANG Li-jun，Dang Feng-qiang，et al.＊Department of Cardiology Ⅳ，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian 116001，China

XIE Lian-na，E-mail：xieln1963@163.com；LANG Ming-fei，E-mail：langmingfei@dlu.edu.cn

Objective This study explored the difference of circulating miR-208b-3p expressions between acute myocardial infarction（AMI） patients and healthy controls（HC）.The diagnostic value of the miR-208b expression in subgroups of AMI patients was also studied.Methods Plasma samples were taken from department of Cardiology，affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，140 AMI patients immediately after admission and 19 healthy controls，time from May 2012 to August 2014.The expression of miR-208b-3p was detected by qRT-PCR after reverse transcription by specific stem-loop primers and was compared with hs-TnI and CK-MB.The expression of miR-208b-3p was also examined in patients with ST segment elevation myocardial infarction（STEMI）and non-ST segment elevation myocardial infarction（NSTEMI）.The diagnostic value of the expression was assessed by ROC.Results The expression levels of plasma miR-208b-3p in AMI and HC groups were 43.86±7.50 and 2.05±0.62，respectively（P＜0.05）.The expression of miR-208b-3p was positively associated with CKMB levels（r=0.546，P＜0.01）.In ROC analysis，the AUC of miR-208b-3p，CK-MB and hs-TnI were 0.874（P＜0.01），0.976（P＜0.01）and 0.971（P＜0.01），respectively.The expression levels of miR-208b-3p in the STEMI and NSTEMI groups were 55.04±10.44 and 21.01±7.13，respectively（P＜0.05），and their AUC were 0.935 （P＜0.01）and 0.749（P＜0.01），respectively.Conclusion Circulating miR-208b-3p could be used as an early diagnostic marker in AMI patients.However，its diagnostic value was no better than that of hs-TnI or CK-MB.The diagnostic sensitivity and specificity of circulating miR-208b-3p were better for STEMI than for NSTEMI patients.

Acute myocardial infarction；Circulating miRNAs；MiR-208b；Diagnosis

116001 辽宁省大连市，大连大学附属中山医院循环四科（张一凡、王丽君、党凤强、齐丽梅、谢莲娜）；大连大学医学院（徐越、郎明非）；大连大学环境与化学工程学院（孙晶）

谢莲娜，E-mail：xieln1963@163.com；郎明非，E-mail：langmingfei@dlu.edu.cn

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.12.015

R542.2+2

A

1672-5301（2016）12-1108-04

2016-06-11）