高密度CO2杀菌蛋清液贮藏期间抗氧化物活性以及过敏源特性变化分析

戴　妍,范　蓓,卢　嘉,侯　猛,韩兆鹏,卢晓明,*

(1.北京德青源农业科技股份有限公司,北京 102115;2.中国农业科学院原子能利用研究所,北京 100193)



高密度CO2杀菌蛋清液贮藏期间抗氧化物活性以及过敏源特性变化分析

戴妍1,范蓓2,卢嘉2,侯猛1,韩兆鹏1,卢晓明1,*

(1.北京德青源农业科技股份有限公司,北京 102115;2.中国农业科学院原子能利用研究所,北京 100193)

研究高密度CO2杀菌和巴氏杀菌处理对贮藏期间蛋清液抗氧化物活性和过敏原特性变化的影响。将蛋清液分对照组、巴氏杀菌处理组(55 ℃水浴杀菌3.5 min)和高密度CO2处理组(分别在10、20、30 MPa压力下杀菌10 min),然后放置于4 ℃恒温贮藏,检测4周贮藏期间蛋白质羟自由基清除能力、DPPH自由基抑制率、还原力以及过敏源特性的变化情况。实验结果显示:高密度CO2杀菌(DPCD)10 MPa处理组蛋清液在1周储藏期间中羟自由基清除率和还原力显著高于(p<0.05)对照处理组。SDS-PAGE实验结果表明,储藏期间DPCD处理并没破坏蛋清液中的重要过敏源——卵白蛋白。

高密度CO2杀菌,抗氧化物,过敏源,蛋清

高密度CO2杀菌技术是一种新型非热力(冷杀菌)技术。在食品工业中使用这种杀菌技术可以最大限度地保留食品中有益成分,是一种绿色洁净技术[1-2]。国内外学者对高密度CO2杀菌技术处理后的绝大多数液体和部分固体食品的理化、品质以及安全特性进行了研究[2-4]。

液态蛋可分为蛋清液、蛋黄液、全蛋液三类[5],液态蛋有很高的营养价值,它可以应用于焙烤、餐饮业、面条、饼干、蛋糕、甜食以及煎蛋等食品的开发[5]。目前液态蛋常用的杀菌方式为巴氏杀菌。工业上液态蛋巴氏杀菌条件为水浴55～66 ℃杀菌2.5～3.5 min。巴氏杀菌法效率高,杀菌效果好,能够延长液蛋产品货架期。但是这种加热杀菌方式在一定程度上破坏了蛋液中营养成分和功能特性,而且它不能从根本上消除蛋液中有害微生物的影响[6]。

食品过敏特性以及抗氧化活性都是影响食品质量和安全最为重要的因素[7-10]。国内仅刘文营[1]初步研究了高密度CO2杀菌处理对于蛋清液在贮藏期间微生物、pH、起泡能力、乳化性、疏水性和表面巯基等方面的影响[1],目前国内外对于高密度CO2杀菌处理对于蛋清液抗氧化物活性与过敏特性的影响仍然是空白。本文通过对蛋清液设置对照、巴氏杀菌以及高密度CO2杀菌处理,比较了它们在4 ℃条件下贮藏4周抗氧化物活性以及过敏特性差异,从抗氧化特性和过敏特性的角度来客观阐明高密度CO2杀菌方式也能够达到或者超过未经处理或巴氏杀菌蛋液水平,从而为高密度CO2杀菌的应用前景以及后期该种技术的标准化提供有价值的参考数据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜壳蛋德青源公司;纯度为99.5%的二氧化碳气体北京千禧京城气体有限公司;biolabs P7710 蛋白Marker北京百灵克公司;三羟甲基氨基甲烷、5,5-二硫二硝基苯甲酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺、甘油、β-巯基乙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、DPPH美国Amresco公司;Urea美国Sigma公司;lowery蛋白浓度测试盒、牛血清白蛋白BSA等药品北京索来宝公司;其它试剂均为分析纯。

Shimadzu UV-1780紫外可见分光光度计日本;SL-Ⅲ型低温层析冷柜;Eppendorf移液器美国;XHF-D匀浆机;H1850R高速冷冻离心机;BG电泳仪北京索来宝公司;Tocan gelation image system凝胶成像仪南京生物技术公司;TS-2脱色摇床金坛仪器有限公司;DK-600B水浴锅、SFT-HPR-1000高密度二氧化碳DPCD处理仪、电子天平等。

1.2实验方法

1.2.1原料处理将新鲜壳蛋破碎,分离出蛋清液,用匀浆器3000 r/min匀浆30 s,取15 mL蛋清液直接放入20 mL离心管中,对照处理组蛋液直接放入4 ℃冷柜中储藏备用,巴氏杀菌处理组则将蛋清液用真空包装袋密封后,置于55 ℃水浴锅,杀菌3.5 min后取出冷却到室温,取15 mL蛋清液直接放入20 mL的离心管中,然后置于4 ℃冷柜中储藏备用,在第0 d、1、2、3、4周进行取样分析。

将鲜蛋清液(20 mL)放入离心管中,采用高密度CO2杀菌法(10、20和30 MPa)处理10 min。处理结束后取出离心管,然后迅速放入4 ℃冷柜中储藏备用[1-2],每个处理组使用4份蛋清液样品。

1.2.2羟自由基清除能力分析羟自由基(OH)清除能力测定方法参考杨瑾[11]的方法,具体如下:用蒸馏水稀释将蛋清液样品至蛋白浓度为5 mg/mL,蛋清蛋白质浓度用lowery试剂盒法测定,然后用羟自由基测定试剂盒测定稀释液的羟自由基(OH)清除能力,在550 nm下比色,羟自由基清除力(%)=[OD对照组-OD样品/OD对照组]×100,式中,OD样品为样品的吸光度值;OD对照组为对照样吸光值(含双蒸水、底物应用液,但不含样品和H2O2)。

1.2.3DPPH自由基清除率分析蛋清液样品的DPPH自由基抑制率测定参考文献[10]。称取0.03 g蛋清液迅速和3 mL 0.004% DPPH-乙醇溶液混合,振荡摇匀。在室温下放置30 min后,以无水乙醇为空白,于517 nm处测定吸光值。吸光值越小代表其清除DPPH自由基能力越强。

1.2.4还原力分析用蒸馏水稀释将蛋清液样品至蛋白浓度为0.5 mg/mL,蛋清液蛋白质浓度用lowery蛋白试剂盒测定。取样品溶液2 mL,加入2 mL 1%的K3(CN)6溶液,置于50 ℃的水浴锅中反应80 min,迅速冷却后离心(3000×g,10 min,20 ℃),取上清液2 mL,加入2 mL去离子水和0.5 mL浓度为0.1%的FeCl3溶液。混合均匀后静置60 min,于700 nm 处测定吸光值,吸光值越大,说明样品的还原力越强[11]。

1.2.5过敏源特性分析特异性过敏源卵白蛋白(ovalbumin)采用SDS-PAGE进行分析:取蛋清液(1 g),加入20 mL蒸馏水,然后使用XHF-D型匀浆机搅拌。搅拌后的蛋清液样品用lowery蛋白浓度测试盒法进行测试。将蛋清液的蛋白质浓度1 mg/mL,然后进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE采用的分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为4%。将蛋清液样品按1∶5与样品缓冲液(含有2% SDS,10% 甘油,1%β-巯基乙醇,pH=6.8的Tris-HCl以及0.05%溴酚兰)混合,混合后的样品液置于100 ℃沸水中加热5 min。取大约含20 μg的样品液上样(使用biolabs P7710蛋白Marker做对照)。电泳分离采用恒流模式(30 mA)保持2.5 h后,取出凝胶后,用考马斯亮蓝R-250染液(1 g/L)染色1 h后,用脱色液(120 mL/L甲醇和75 mL/L乙酸)隔夜脱色。脱色后的凝胶用凝胶成像仪拍照[12-14]。

1.2.6数据处理用SPSS 16.0 数据分析软件对各指标进行分析,Unpaired Student T-test 用于分析各处理组蛋清液各指标显著性差异(p<0.05)。

2　结果与分析

2.1巴氏杀菌和高密度CO2杀菌对蛋清液样品DPPH自由基能力的影响

在0～4周的储藏时间中,对照组、巴氏杀菌处理组以及高密度CO2(10、20、30 MPa)杀菌处理组蛋清液中DPPH吸光值呈现出一种先上升后缓慢下降的趋势(图1),这与Liu等[15]研究储藏期内蛋液的DPPH变化趋势一致。原因可能是储藏期间导致蛋清液发生水解和氧化,水解作用强于氧化作用,因此会使蛋清液中产生更多的DPPH自由基抑制产物[16]。

图1　储藏期间DPPH的变化分析 Fig.1　DPPH variation during storage

第0 d高密度CO230 MPa杀菌处理组蛋清液中DPPH吸光值显著高于(p<0.05)巴氏杀菌处理组吸光值。第1周高密度CO2(10 MPa和20 MPa)杀菌处理组蛋清液的DPPH值显著高于(p<0.05)对照处理组,其余各组无明显差别(p>0.05)。第3周高密度CO230 MPa杀菌处理组DPPH值显著低于(p<0.05)对照处理组。第4周高密度CO210 MPa杀菌处理组DPPH值显著低于(p<0.05)对照处理组,其他各处理组无显著性差异(p>0.05)。Tong[17]等认为食品DPPH吸光度升高则代表DPPH自由基抑制率(抗氧化特性)下降,反之如果食品DPPH吸光值降低则代表DPPH自由基抑制率的增强。上述结果可以看出在储藏后期高密度CO2杀菌处理组蛋清液DPPH自由基抑制率略好于对照处理组,而它与巴氏杀菌处理组蛋清液相比则无任何差别。

2.2蛋清液样品羟自由基清除能力分析

羟自由基是一种最具有反应特性,对临近生物分子最具有损伤特性的含氧自由基[16]。在0～4周储藏时间中,对照处理组、巴氏杀菌处理组以及高密度CO2(10、20、30 MPa)杀菌处理组蛋清液中羟自由基清除率呈现上升的趋势(图2)。原因可能是4 ℃储藏期间可能导致蛋清液中卵粘蛋白-溶菌酶等复合体水解,从而产生更多羟自由基抑制产物[18],引起自身抗氧化能力在一定程度的增加。

图2　储藏期间羟自由基清除率的变化分析 Fig.2　Hydroxyl radical scavengingability variation during storage

高密度CO230 MPa杀菌处理组蛋清液在0 d和1周羟自由基清除率显著低于(p<0.05)其他处理组。第1周高密度CO210 MPa杀菌处理组蛋清液羟自由基清除率显著高于巴氏杀菌、高密度CO220 MPa和30 MPa杀菌处理组(p<0.05)。第3周高密度CO220 MPa和30 MPa杀菌处理组蛋清液羟自由基清除率显著高于(p<0.05)巴氏杀菌处理组。第4周高密度CO220 MPa杀菌处理组蛋清液羟自由基清除率显著低于(p<0.05)对照处理组和巴氏杀菌处理组,其余各处理组之间差异不大。这种高密度CO230 MPa杀菌处理比起单纯的巴氏杀菌处理可能会引起蛋清液中更多抗氧化物活性酶钝化,因此在储藏第0～1周时它的羟自由基清除率低于其他处理组,后期可能随着蛋清液的水解产生更多羟自由基抑制产物,部分抗氧化物酶活性恢复,引起储藏第4周时高密度CO230 MPa杀菌处理组蛋清液羟自由基清除率的提高。

2.3蛋清液样品还原力分析

还原力(reducing powder)是表征食品抗氧化特性的重要指标。食品还原力吸光度值越高,其抗氧化能力越强[10]。对照组、巴氏杀菌处理组以及高密度CO2(10、20、30 MPa)杀菌处理组蛋清液在0 d到第4周储藏期中还原力吸光值呈现先上升后缓慢下降的趋势(图3),所有处理组蛋清液的还原力吸光值在第1周达到最大,随后则呈现下降趋势。第0 d高密度CO210 MPa杀菌处理组蛋清液还原力值显著低于(p<0.05)巴氏杀菌处理组。在第1周时,高密度CO210 MPa杀菌处理组蛋清液还原力值显著高于(p<0.05)对照处理组。第2周高密度CO230 MPa杀菌处理组蛋清液的还原力值显著高于(p<0.05)巴氏杀菌处理组。在其他储藏期间,各处理组还原力值无显著性差异(p>0.05)。在储藏前期(1～2周)时间,高密度CO2杀菌处理组蛋清液还原力水平可能要略高于对照和巴氏杀菌处理组,但后期高密度CO2杀菌与其他处理组之间差异性不大。

图3　储藏期间还原力变化分析 Fig.3　Reducing power variation during storage

2.4蛋清液样品过敏特性分析

图4表示对照、巴氏杀菌、高密度CO2(10、20、30 MPa)杀菌处理组蛋清液SDS-PAGE分析。图4显示蛋清液经SDS-PAGE处理后显示的主要蛋白条带有5条,分子量约为60、52、40、32、27 ku。本实验结果与吴序栎等[8]和赵伟[19]等研究的蛋清液主要蛋清液电泳条带结果基本吻合。在前人文献已经鉴定出的蛋清液蛋白电泳条带中[20],卵粘蛋白、卵转铁蛋白,卵白蛋白和溶菌酶分子量分别为250、78、43和14.3 ku。蛋清液中卵白蛋白和卵转铁蛋白是主要过敏源[8],卵白蛋白对水解以及人体消化作用具有很强抵抗性,因此这种蛋白质非常容易和人体中IgE和IgG等免疫球蛋白结合引发过敏[21]。从图4中的SDS-PAGE图谱可以看出,储藏期间所有处理组过敏源卵白蛋白并未发生明显变化,高密度CO2杀菌处理并未使蛋清液中卵白蛋白更大程度的变性。各组样品蛋清液卵白蛋白电泳条带无明显差异。

图4　储藏期间各处理组蛋清液电泳分析Fig.4　SDS-PAGE patterns of liquid egg white treatment groups during storage

3　结论

在4 ℃储藏期间,对照组、巴氏杀菌以及高密度CO2(10、20、30 MPa杀菌处理组)蛋清液DPPH自由基清除率和还原力呈现出先上升后下降的趋势,而羟自由基(OH·)清除能力呈现出缓慢上升的趋势。第0 d～1周时,高密度CO2杀菌处理组蛋清液DPPH较高,因此这种处理方式的DPPH自由基抑制率较差,第3～4周时,高密度CO2(10、30 MPa)杀菌处理组蛋清液的DPPH较低,它的DPPH自由基抑制率显著高于对照处理组。第1～3周时,高密度CO210 MPa和30 MPa杀菌处理组蛋清液显示了较高的还原力,分别高于对照处理组和巴氏杀菌处理组。第1周高密度CO210 MPa杀菌处理组蛋清液的羟自由基清除率显著高于巴氏杀菌处理组,高密度CO220 MPa和30 MPa杀菌处理组。第3～4周高密度CO230 MPa杀菌处理组蛋清液具有较高的羟自由基清除率。高密度CO210 MPa杀菌处理蛋液组具有较好的抗氧化物活性水平,因此采用这种高密度杀菌方式可以达到短期钝化蛋清液中的抗氧化物酶水平或是降低了水解和氧化作用,从而在一定程度上提升了蛋清液的抗氧化能力。单纯采用高密度CO2杀菌技术并没有起到破坏蛋清液中重要过敏源(卵白蛋白)的作用。在抗氧化物活性与过敏源特性方面,高密度CO2杀菌、对照组和巴氏杀菌处理组蛋液差异性不大。针对高密度二氧化碳处理影响蛋清液功能性的机理和影响方式,至今还不清晰,尚需更深入的研究。

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The changes of antioxidation parameters and antigenicity characteristics of ovalbumin in refrigerated-storage liquid egg white samples during dense phase carbon dioxide sterilization treatments

DAI Yan1,FAN Bei2,LU Jia2,HOU Meng1,HAN Zhao-peng1,LU Xiao-ming1,*

(1.Beijing DQY Egg Safety Agricultural Technology Co.,Ltd.,Beijing 102115,China;2.The Chinese Academy of Agricultural Sciences Institute of Atomic Energy Use,Beijing 100193,China)

In order to investigate the changes of antioxidant parameters and antigenicity characteristics of ovalbumin in liquid egg white samples treated by dense phase carbon dioxide sterilization and pasteurization treatment during refrigerated storage,the samples of liquid egg white were divided in control,pasteurization(treated at 55 ℃ for 3.5 min in a waterbath)and dense phase carbon dioxide sterilization(treated at 10 MPa,20 MPa and 30 MPa respectively for 10 min),and the samples were directly investigated during refrigerated storage at 4 ℃.The hydroxyl radical scavenging ability,DPPH radical scavenging ability,reducing powder and antigenicity characteristics were detected in these samples during 4 ℃ refrigerated-storage for 4 weeks. The results showed that the samples of liquid egg white under 10 MPa dense phase carbon dioxide sterilization(DPCD)treatments had significantly higher(p<0.05)hydroxyl radical scavenging ability and reducing powder than control group at first week. The results of SDS-PAGE showed that dense phase carbon dioxidesterilization treatments could not destroy the main antigenicity(ovalbumin)overall.

dense phase carbon dioxide sterilization;antioxidant;antigenicity;egg white

2015-10-22

戴妍(1986-)，女，博士，助理研究员，研究方向：蛋品科学与加工技术，E-mail:daiyan@dqy.com.cn。

卢晓明(1982-)，女，高级研究员，主要从事蛋品科学与加工技术方面的研究，E-mail:luxiaoming@dqy.com.cn。

蛋制品加工技术研发与产业化示范(2012BAD28B08)；公益性行业(农业)科研专项(201303084)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)12-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.014