分心木酸性多糖SJP-2的理化性质及其抗氧化活性研究

邵双双,贺　亮,韦朝阳,李卫旗,*

(1.浙江大学生命科学学院,浙江杭州 310058;2.浙江省林业科学研究院生物技术所,浙江杭州 310023)



分心木酸性多糖SJP-2的理化性质及其抗氧化活性研究

邵双双1,贺亮2,韦朝阳1,李卫旗1,*

(1.浙江大学生命科学学院,浙江杭州 310058;2.浙江省林业科学研究院生物技术所,浙江杭州 310023)

以分心木为原料进行热水浸提,经过醇沉、脱色素、脱蛋白以及DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephadex-G50凝胶柱色谱分离纯化得到一种酸性多糖组分(SJP-2),再对该组分进行理化性质及抗氧化活性分析。结果表明:SJP-2不含蛋白,是一个低分散度,分子量较为均一的多糖,分子量为3.239×103g/mol;HPLC分析得知SJP-2为一种酸性多糖,其单糖组成及摩尔比例为阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸=1∶2.62∶4.45∶18.53;抗氧化活性测得SJP-2清除DPPH自由基、羟自由基以及ABTS自由基的IC50分别为0.094、0.945、0.591 mg/mL,还原能力在1.0 mg/mL时达到1.158,ORAC值为(1217.99±31.22) μmol TE/g,说明SJP-2具有较高的体外抗氧化能力。

分心木,多糖,分离纯化,理化性质,抗氧化

分心木(SemenJuglandis)为胡桃科胡桃属植物胡桃(JuglansregiaL.)果核内的木质隔膜,别名隔心木,胡桃衣,胡桃夹,胡桃隔,胡桃芯。呈薄片状,多弯曲、破碎而不整齐,完整者呈类圆形或椭圆形,表面棕色至浅棕褐色,稍有光泽,边缘不整齐,体轻,质脆,易折断,气微,味微涩,在我国南北方均有栽培[1]。分心木可以治疗牙龈出血、口腔溃疡、结石、腰痛等疾病,具有补肾涩精、利尿清热等功效[2]。王艳等[3]对维吾尔药核桃分心木进行研究,发现分心木95%乙醇提取物、正丁醇提取物以及水提取物均不同程度地改善了小鼠模型肾阳虚的症状。

多糖不仅是细胞的结构物质和能源物质,而且是一种重要的生物活性物质。越来越多的研究表明,多糖是除了蛋白质和核酸之外另一种重要的生命物质,具有多方面、复杂的生物活性及功能[4]。多糖在对肿瘤、肝炎、心血管病等疾病的预防和治疗,以及在调节糖代谢和抗氧化等方面显示出良好的应用前景,而且多糖广泛存在于动物、植物以及微生物中,毒副作用低,因此被广泛研究和开发应用[5]。

近年来,有关分心木化学成分及其生物活性的研究已经逐渐展开,其中对黄酮提取以及含量测定的研究比较多,对多糖的研究却很少,而多糖又是分心木中主要的活性成分之一[6-8]。本实验首次对分心木的多糖进行提取分离纯化,并对其理化性质和抗氧化活性进行研究,为其多糖类活性物质的开发利用提供科学依据。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

分心木浙江省林业科学研究院;无水乙醇、氯仿等试剂分析纯,国药集团化学试剂有限公司;浓硫酸、盐酸杭州化学试剂有限公司。

CL31R型多功能高速离心机美国Thermo公司;R-210型旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司;DZF6020 型真空干燥箱 上海博讯实业有限公司;冷冻干燥机美国LABCONCO公司;U-1900型可见分光光度计日本HITACHI公司;Spectra Max M2多功能酶标仪美国分子仪器公司;AKTA purifier层析系统美国GE医疗集团;戴安U-3000型高效液相色谱仪美国Dionex公司;多角度激光光散射仪(DAWN-II)美国Wyatt Technology Co。

1.2实验方法

1.2.1酸性多糖的提取及分离纯化分心木用粉碎机粉碎后,过20目筛,按料液比为1∶20(m/v)的比例,加去离子水,90 ℃浸提2 h,8000 r/min,离心15 min,收集上清液,滤渣重复提取1次,合并2次提取液。提取液在50 ℃下减压浓缩,冻干得粗多糖。粗多糖溶于水,双氧水法脱色素后,浓缩,透析(1000 u),然后采用Sevage法脱蛋白,将脱完色素蛋白的多糖样品,过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱(2.0 cm×35 cm),按照顺序用蒸馏水、0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mol/L 的NaCl溶液进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,每管收集4 mL,苯酚-硫酸法检测糖分布,最后用Sephadex-G50凝胶柱色谱(1.0×64 cm)对多糖进一步纯化,蒸馏水做洗脱液,流速为0.5 mL/min,每管收集4 mL,苯酚-硫酸法检测糖分布,可得到分心木纯化后的多糖组分SJP-2[9]。

1.2.2蛋白含量测定考马斯亮蓝G250法[10]。

1.2.3分子量及纯度测定将激光光散射检测器与示差折光检测器联用对多糖分子量及其纯度进行鉴定,配制0.1 mol/L NaNO3溶液作为流动相,过0.22 μm膜,超声脱气30 min。称取3 mg多糖样品溶解于1 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液中,磁力搅拌溶解4 h,过0.22 μm膜,采用Astra软件采集散射信号并进行数据处理[11]。

1.2.4单糖组成单糖组成的测定,参考Dai等[12]的方法,并做了适当的修改。

多糖水解:称取3 mg多糖,加入1 mL 4 mol/L TFA溶液,121 ℃水解6 h,加入200 μL甲醇,60 ℃真空离心浓缩,去除残留的三氟乙酸,反复3次,加入50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液溶解。

单糖及多糖水解液的PMP衍生化:准确称取10种单糖标准品,加去离子水配成5 mmol/L的单糖标准液,取100 μL单糖标样溶液,分别加入100 μL NaOH(0.6 mol/L)溶液,混匀得到2.5 mmol/L的单糖标准液。取50 μL多糖水解后溶液及10种2.5 mmol/L的单糖标样溶液,分别加入50 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇液,混匀,70 ℃水浴100 min,然后加入50 μL 0.3 mol/L HCl,加水至总体积为1 mL后,加入1 mL氯仿,震荡、离心除去PMP等杂质,收集水相,重复5次,过0.45 μm膜,待HPLC。

RP-HPLC测定条件:检测波长为245 nm,流速为1.0 mL/min,柱温:25 ℃,柱子:HYPERSIL APS-2(4.6×250 mm,5 μm,Thermo,USA),进样体积为10 μL,流动相A(乙腈):流动相B(PBS缓冲液,pH6.8)=15∶85。

1.2.5抗氧化活性研究

1.2.5.1DPPH自由基清除率测定参考李志平等[13]的方法,在试管中加入1.0 mL溶于95%乙醇的DPPH(0.2 mmol/L),然后加入1.0 mL不同浓度的样品溶液,混匀,室温黑暗静置30 min,于517 nm处测定吸光值,VC作为阳性对照,DPPH自由基的清除率通过以下公式计算:

式中:A0为空白样品吸光值,As加样后的吸光值,Aj为以蒸馏水代替DPPH的吸光值。

1.2.5.2羟自由基清除率参考Mao等[14]的测定方法并稍作修改,具体方法为:2.0 mL FeSO4溶液(6 mmol/L)与2.0 mL不同浓度的样品混匀,加入2 mL H2O2(6 mmol/L),摇匀,室温静置10 min后,加入2.0 mL水杨酸(6 mmol/L),混匀,室温静置10 min,于510 nm处测定吸光值,VC作为阳性对照,对羟自由基的清除能力按照下面公式进行计算:

式中:A0为空白样品吸光值,As加样后的吸光值,Aj为以蒸馏水代替H2O2的吸光值。

1.2.5.3还原力参考Akbari等[15]的方法,在试管中加入不同浓度样品液,依次加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(pH6.6,0.2 mol/L),2.5 mL铁氰化钾(1%,w/v),摇匀,50 ℃水浴20 min后,加入2.5 mL三氯乙酸(10%,w/v),离心(1200 r/min,10 min),吸取2.5 mL上清液与2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3(0.1%,w/v)混匀,室温静置10 min,于700 nm处测定吸光值,VC作为阳性对照,样品反应后吸光值越高,还原能力越强。

1.2.5.4ABTS自由基清除率参考Luo等[16]的实验方法,ABTS+·溶液(7 mmol/L)用75%乙醇稀释,在734 nm处调整吸光值为0.70±0.02,0.1 mL样品液与3.9 mL of ABTS+·溶液在试管中混匀,室温反应10 min,在734 nm处测定吸光值,VC作为阳性对照,按照下式计算对ABTS自由基的清除率:

式中,A0为空白样品吸光值,As加样后的吸光值。

1.2.5.5氧自由基吸收能力(ORAC)总的反应混合液为200 μL,在96孔板的微孔中加入20 μL荧光素(35 nmol/L),40 μL待测样品液和140 μL AAPH(12.8 mmol/L)。该反应在75 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)体系中进行,检测温度为37 ℃,激发波长为485 nm,发射波长为528 nm,每隔2 min测定一次吸光强度,持续98 min。各个微孔不同时间点的绝对荧光强度与其初始时间的荧光强度之比,得到相对荧光强度,以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光衰退曲线下面积(AUC)。Net AUC=AUCsample-AUCblank,Net AUC与抗氧化物的浓度成正相关。ORAC值即Trolox当量(TE),以μmol TE/g表示[17]。

1.3数据分析

采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0软件对相关数据进行统计分析。

2　结果与分析

2.1酸性多糖的提取及分离纯化

分心木经过热水浸提以及乙醇沉淀后得到粗多糖。由图1A可知,多糖脱色素脱蛋白后,经过DEAE-Sepharose Fast Flow柱分离,得到两个组分,命名为:SJP-1和SJP-2,其中组分SJP-1含量为10.92%,SJP-2含量为89.08%。SJP-1的得率与SJP-2相比较低,所以选取主要组分SJP-2经过Sephadex-G50 凝胶柱进一步纯化,得到单一对称的洗脱峰,如图1B,由图表明经过凝胶柱进一步纯化后获得了纯度较高的多糖组分。

图1　分心木多糖的DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sephadex-G50柱层析洗脱曲线Fig.1　Elution profile of polysaccharide from Semen Juglandis on DEAE-Sepharose Fast Flow columnand gel filtration on Sephadex-G50

2.2酸性多糖SJP-2的蛋白含量

考马斯亮蓝G250测得牛血清白蛋白标准曲线线性方程为:y=0.2136x-0.0097,R2=0.9992,根据标准曲线计算得知SJP-2不含蛋白。

2.3酸性多糖SJP-2的分子量及纯度

如图2所示,样品峰出现在10～20 min之间,90°光散射和示差检测器RI所产生的峰形具有相似大小和形状,几乎完全重叠,并且显示多糖呈现单一对称峰,表明SJP-2为均一性的多糖。同时,测得SJP-2多糖纯度达到99.61%,分子量Mw=3.239×103g/mol,Mw/Mn=1.023。Mw/Mn表示样品的分散度,分子量分布越宽,分散度就越大[18]。Mw/Mn比较接近1,表明SJP-2是一个低分散度的多糖。

图2　SJP-2在0.1 mol/L NaNO3溶液25 ℃的 SEC-MALLS尺寸排阻色谱图Fig.2　SEC chromatogram of SJP-2 in 0.1 mol/L NaNO3 solution at 25 ℃ detected by SEC-MALLS

2.4酸性多糖SJP-2的单糖组成

如图3所示,A为10种单糖标准品的HPLC图,B为SJP-2单糖组成的HPLC图。由图可知,SJP-2多糖的单糖组成及摩尔比例为:阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸=1∶2.62∶4.45∶18.53,其中,半乳糖醛酸含量最高,为69.97%,说明SJP-2为酸性多糖糖,这与高莉等[19]得到的核桃隔膜多糖的单糖组成(阿拉伯糖∶果糖∶甘露糖∶鼠李糖∶葡萄糖=2.11∶6.25∶8.81∶12.59∶15.58)具有较大差异,这可能与实验样品不同有关。

图3　10种单糖标准品与SJP-2的HPLC色谱图Fig.3　The HPLC chromatogram of 10 standard monosaccharides and SJP-2

2.5酸性多糖SJP-2的体外抗氧化活性

2.5.1DPPH自由基清除率如图4所示,在0.02～0.10 mg/mL范围内,随着浓度的升高,VC和SJP-2对DPPH自由基的清除能力逐渐增强;在0.1 mg/mL时,VC和SJP-2对DPPH自由基的清除率分别达到99.68%和53.90%,SJP-2的IC50为0.094 mg/mL,清除DPPH自由基的能力比VC弱,但是与钟葵等[20]测得的绿豆多糖酸性组AEMP-2对DPPH自由基的清除能力(IC50为0.103 mg/mL)相近。

图4　VC和SJP-2对DPPH自由基的清除率Fig.4　DPPH scavenging activity of VC and SJP-2

2.5.2羟自由基清除率如图5所示,在实验浓度范围内,随着浓度的增加,VC和SJP-2对羟自由基的清除能力越强;当浓度为1.0 mg/mL时,VC和SJP-2对羟自由基清除力大小分别为99.01%和54.68%,VC和SJP-2清除羟自由基的IC50分别为0.291 mg/mL和0.945 mg/mL,SJP-2对羟自由基的清除能力要低于VC,但比高莉等[21]测得多糖PDJL和PDJL-A3清除羟自由基的能力要高。

图5　VC和SJP-2对羟自由基的清除率Fig.5　Hydroxyl radical scavenging activity of VC and SJP-2

2.5.3还原力如图6所示,在0.2～1.0 mg/mL范围内,随着浓度的增大,VC和SJP-2的还原能力越大;在0.2 mg/mL时,VC和SJP-2还原能力大小分别为0.637和0.295,在1.0 mg/mL时,VC和SJP-2还原能力大小分别为1.523和1.158,SJP-2还原能力要比VC的还原能力弱。

图6　VC和SJP-2的还原能力Fig.6　Reducing power of VC and SJP-2

2.5.4ABTS自由基清除率如图7所示,在0.2～1.0 mg/mL测定范围内,随着浓度增加,VC和SJP-2对ABTS自由基的清除能力逐渐增强;在1.0 mg/mL时,VC和SJP-2对ABTS自由基的清除率分别为100%和68.05%,SJP-2清除ABTS自由基的IC50为0.591 mg/mL,SJP-2对ABTS自由基的清除能力要比VC弱。

图7　VC和SJP-2对ABTS自由基的清除率Fig.7　ABTS scavenging activity of VC and SJP-2

2.5.5氧自由基吸收能力(ORAC)如图8所示,A为标准品Trolox在不同浓度下的相对荧光强度衰退曲线,B为SJP-2为1.25 μg/mL时的相对荧光强度衰退曲线。Trolox系列标准液标准曲线线性方程为:y=1.0581x+4.0779,R2=0.9991。根据标准曲线线性方程计算得到,SJP-2的ORAC值为(1217.99±31.22) μmol TE/g,与赵谋明等[22]测得去皮核桃仁酶解物的ORAC值(约为1200 μmol TE/g)相当。

图8　Trolox标准品及SJP-2多糖荧光衰退曲线Fig.8　Fluorescence decay curve of Trolox and SJP-2注:A为不同浓度的Trolox标准品的荧光衰退曲线, B为SJP-2多糖的荧光衰退曲线。

3　结论

分心木经过水提醇沉,脱色素脱蛋白,以及DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephadex-G50凝胶柱色谱的分离纯化,得到酸性多糖组分SJP-2。考马斯亮蓝G250法测得SJP-2不含蛋白;激光光散射检测器与示差折光检测器联用检测分析得知SJP-2纯度达到99.61%,是一个低分散度,分子量较为均一的多糖,其分子量大小为3.239×103g/mol;高效液相色谱分析表明,SJP-2为酸性多糖,其单糖组成及摩尔比例为阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶半乳糖醛酸=1∶2.62∶4.45∶18.53,其中半乳糖醛酸含量最高(69.97%);抗氧化活性测定得知SJP-2清除DPPH自由基、羟自由基以及ABTS自由基的IC50分别为0.094、0.945、0.591 mg/mL,还原能力在1.0 mg/mL时达到1.158,ORAC值为(1217.99±31.22) μmol TE/g,说明SJP-2具有较高的体外抗氧化能力,可以作为天然的抗氧化添加剂应用到食品、化妆品和药品等行业,为分心木多糖的开发及利用提供理论依据。

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Physicochemical properties and antioxidant activity of acid polysaccharide sjp-2 fromSemenJuglandis

SHAO Shuang-shuang1,HE Liang2,WEI Chao-yang1,LI Wei-qi1,*

(1.College of Life Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Institute of Biological Technology,Zhejiang Forestry Academy,Hangzhou 310023,China)

The polysaccharide SJP-2 fromSemenJuglandiswas obtained by hot water extraction and alcohol precipitation,and purified using DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography and Sephadex-G50 gel column chromatography. The physicochemical properties and antioxidant activity of SJP-2 were determined. The result showed that SJP-2 without proteins,was a lower dispersion polysaccharide with uniform molecular of 3.239×103g/mol,and the purity was 99.61%. The SJP-2 was acid polysaccharide determined by HPLC,and composed of arabinose,galactose,glucose,and galacturonic acid with a molar ratio of 1∶2.62∶4.45∶18.53. The IC50of DPPH scavenging activity,hydroxyl radical scavenging activity,and ABTS scavenging activity were 0.094,0.945,0.591 mg/mL,respectively. At 1 mg/mL,the reducing power was 1.158. The ORAC of SJP-2 was(1217.99±31.22) μmol TE/g. It was demonstrated that SJP-2 had higher antioxidant activity.

SemenJuglandis;polysaccharide;isolation and purification;physicochemical properties;antioxidant activity

2015-06-03

邵双双(1990-)，女，硕士在读，研究方向：微生物学，E-mail:shaoshuanger@sina.com。

李卫旗(1964-),男，博士，副教授，研究方向：天然产物加工，E-mail:liweqi2014@sina.com。

浙江省重大科技攻关项目(2012C12004-4)；浙江省科技计划项目(2014C32085)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)05-0059-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.003