云南中蜂与意蜂石榴蜜理化性质及体外抗氧化差异性研究

张　政,刘宇佳,陈　超,郭　妍,赵风云1,,*

(1. 甘肃农业大学食品科学与工程学院,兰州甘肃 730070; 2.昆明理工大学食品安全研究院,云南昆明 650500; 3.华南农业大学食品学院,广东广州 510641; 4.华南农业大学应用化学系,广东广州 510641)



云南中蜂与意蜂石榴蜜理化性质及体外抗氧化差异性研究

张政1,2,3,刘宇佳4,陈超2,郭妍2,赵风云1,2,*

(1. 甘肃农业大学食品科学与工程学院,兰州甘肃 730070; 2.昆明理工大学食品安全研究院,云南昆明 650500; 3.华南农业大学食品学院,广东广州 510641; 4.华南农业大学应用化学系,广东广州 510641)

本文对云南蒙自地区中华蜜蜂与意大利蜜蜂在同一地点采集的石榴蜜进行理化指标及体外抗氧化活性研究,结果表明:中蜂石榴蜜的灰分、酸度、总酚、果糖含量显著高于意蜂石榴蜜,而葡萄糖含量、淀粉酶值、氨基酸总量以及必需氨基酸含量显著低于意蜂石榴蜜。体外抗氧化实验表明,中蜂石榴蜜的羟自由基清除能力和还原力均高于意蜂石榴蜜,而DPPH自由基清除能力低于意蜂石榴蜜。本研究首次报道了同一采集环境下的中、意蜂石榴蜜的差异性,为云南特色蜂蜜的开发利用提供了理论依据。

石榴蜜,中华蜜蜂,意大利蜜蜂,理化指标,抗氧化活性

蜂蜜指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物混合后,经充分酿造而成的天然甜物质[1],其主要成分为果糖、葡萄糖及少量蔗糖,还含有氨基酸、类黄酮、多酚类、活性酶等超过180种活性物质[2],具有抗氧化、抗菌、增强免疫力等多种功效[3]。

中华蜜蜂(Apisceranaceraca,简称中蜂)是我国最具优势,分布最广的本土蜜蜂资源。西方蜜蜂原产于欧、非洲,因有较高的生产性能,于19世纪末引入我国,西方蜜蜂中意大利蜜蜂(A.melliferaligustica,简称意蜂)是我国目前饲养的主要蜂种[4]。中蜂与意蜂同属于蜜蜂属的不同亚种[5],但两种蜜蜂生存环境的差异影响了它们的进化结果,从而造成许多行为学、生物学等方面的差异,进一步导致了中、意蜂蜂蜜的差异。蜜蜂属各种类都具有在蜂群间互相盗蜜的行为,又称盗蜂[6]。当中蜂、意蜂同场饲养时,容易产生盗蜂现象,故同一地点饲养的中、意蜂所产蜂蜜的对比研究鲜有报道。

云南蒙自是全国石榴种植面积最大的地区之一[7],在中蜂或意蜂的授粉作用下,生产出云南特色蜂蜜——石榴蜜(Punicagranatumhoney),该地区通过科学管理在实验蜂场同时饲养了中蜂和意蜂,本文对比了两种蜜蜂在相同时间生产的石榴蜜的理化性质及体外抗氧化能力的差异性,旨为消费者科学选购蜂蜜提供参考,并可补充云南特色蜂蜜产品研究的不足。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜石榴蜜于2014年5月采自云南省农科院蜜蜂研究所实验蜂场,中蜂与意蜂蜂场直径距离约300 m,从不同蜂箱采集中蜂和意蜂石榴蜜各5个样本,所有样本均为封盖成熟蜜;试剂均为市售分析纯;果糖、葡萄糖和蔗糖标准品购自贵州迪大生物科技有限公司;乙腈色谱纯,产于美国TEDIA公司;实验用水均为超纯水。

AL204型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;UPHW-I-90T优普系列超纯水机成都超纯科技有限公司;TU1901型双束紫外可见分光光度计北京普析通用有限责任公司;835-50型氨基酸自动分析仪日立(中国)研究开发有限公司;Agilent 1260高效液相色谱仪-示差折光检测器(HPLC-RI)美国安捷伦仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1石榴蜜中理化指标的测定葡萄糖、果糖和蔗糖含量测定:采用HPLC-RI法进行测定。色谱柱为Carbomix Pb-NP糖柱7.8 cm×300 mm;流动相为超纯水,使用前过滤并超声脱气;流速为0.450 mL/min;示差折光检测器温度为30 ℃;进样量为10 μL。

氨基酸含量测定:采用氨基酸自动分析仪。

总酚含量测定:采用Folin-Ciocalteu法[8],以没食子酸为标准品。

水分、灰分、酸度、淀粉酶值的测定均参照GH/T 18796-2012。

1.2.2石榴蜜的体外抗氧化能力测定

1.2.2.1羟自由基清除力参照Smirnoff N等[9]的方法测定。取1 mL稀释为一定浓度梯度的蜂蜜溶液,依次加入0.3 mL 8 mmol/L的FeSO4,0.25 mL 20 mmol/L的H2O2,l mL 3 mmol/L水杨酸,混匀,37 ℃水浴30 min,取出,冷却,加入0.45 mL的蒸馏水,混匀,2000 r/min离心10 min,取上清液于510 nm测吸光度。以蒸馏水代替样品作为空白。以VC作为阳性对照。清除率(%)=(1-A样/A对照)×100,IC50值表示清除率为50%时蜂蜜/VC浓度。

1.2.2.2DPPH自由基清除力参照Rodrigo S等[10]的方法测定。取0.4 mL稀释为一定浓度梯度的蜂蜜溶液,加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液,混匀,暗处放置30 min并不断震荡,在517 nm处测其吸光值。以蒸馏水代替样品作为空白。以VC作为阳性对照。清除率计算公式为:清除率(%)=(1-A样/A对照)×100,IC50值表示清除率为50%时蜂蜜/VC浓度。

1.2.2.3还原力参照Jing H等[11]的方法测定。FRAP工作液的制备:300 mmol/L醋酸盐缓冲液(3.1 g的乙酸钠+16 mL冰乙酸,用蒸馏水定容到1000 mL,pH3.6),10 mmol/L的TPTZ的40 mmol/L HCl溶液,20 mmol/L的FeCl3溶液,用时以10∶1∶1的体积比混合,并37 ℃预热备用。量取0.15 mL稀释为一定浓度梯度的蜂蜜溶液,加入4.5 mL预热至37 ℃的FRAP 工作液,摇匀后,37 ℃水浴反应10 min,于593 nm处测定反应液吸光值,以蒸馏水代替样品作为空白。以VC作为阳性对照,以0～1000 μmol/L FeSO4-TPTZ复合物在593 nm处的吸光值为参考标准,蜂蜜的还原能力以达到同样吸光值所对应的FRAP值(μmol/L FeSO4)来表示,FRAP值越大,还原能力越强。EC50值表示还原能力为500 μmol/L FeSO4时所对应的蜂蜜/VC浓度。

1.3数据统计

每个实验重复三次,测定结果表示为平均值±标准差。实验数据的统计利用Microsoft Office 2010软件,显著性分析利用SPSS 17.0软件,差异显著性水平为p<0.05。

2　结果与分析

2.1中蜂和意蜂酿制石榴蜜理化指标分析

通过对中、意蜂石榴蜜的各项理化指标进行测定,结果如表1所示,中蜂石榴蜜的灰分、酸度、总酚、果糖含量显著(p<0.05)高于意蜂石榴蜜,葡萄糖含量和淀粉酶值显著(p<0.05)低于意蜂石榴蜜,两种石榴蜜的水分和蔗糖含量之间没有显著差异。

2.2中蜂与意蜂酿制石榴蜜的氨基酸分析

实验对比了中、意蜂石榴蜜样品中的氨基酸种类与含量。由表2可知,中蜂石榴蜜样品中氨基酸的总量为10.011 mg/g,主要含有Asp、Glu、Leu,占总含量的56.16%;必需氨基酸含量为2.913 g/mg,占总含量的29.10%。意蜂石榴蜜样品中氨基酸总量为12.848 mg/g,主要含有Asp、Glu、Pro、Tyr、Leu,占总含量的59.44%;必需氨基酸含量为4.026 g/mg,占总含量的31.34%。

表1　中蜂与意蜂酿制石榴蜜的理化指标对比

注:每个指标表示为平均值±标准差,n=5。同一行不同字母代表数值间的差异显著(p<0.05)。

表2　中蜂与意蜂酿制石榴蜜的氨基酸含量对比

注:*为人体必需氨基酸;“-”代表未检出。

2.3中蜂与意蜂酿制石榴蜜体外抗氧化活性

2.3.1羟基自由基清除能力实验对比了同一地点饲养的中蜂与意蜂石榴蜜样品在0～0.05 g/mL浓度范围内对羟自由基的清除作用。由图1可知,随着蜂蜜浓度的增加,两者对羟自由基的清除率先上升后趋于平缓。当浓度达到0.049 g/mL时,中、意蜂石榴蜜对羟自由基的清除率分别达到了78.41%和76.76%。中、意蜂石榴蜜对羟自由基均有一定清除能力,对曲线进行拟合,求得IC50值分别为0.0154 g/mL和0.0189 g/mL,中蜂石榴蜜对羟自由基的清除能力强于意蜂石榴蜜。

图1　中蜂与意蜂石榴蜜对羟自由基的清除能力对比Fig.1　Scavenging ability to hydroxyl free radical of P. granatum honey between A. cerana cerana and A. mellifera ligustica

2.3.2DPPH自由基清除能力对比中、意蜂石榴蜜在0～0.30 g/mL浓度范围内对DPPH自由基的清除能力,如图2所示,中、意蜂石榴蜜对DPPH自由基有不同程度的清除作用,且清除率随样品浓度的升高而变大。中、意蜂石榴蜜的IC50值分别为0.2033 g/mL和0.1688 g/mL,意蜂石榴蜜对DPPH自由基的清除能力强于中蜂石榴蜜。

图2　中蜂与意蜂石榴蜜对DPPH自由基的清除能力对比Fig.2　Scavenging ability to DPPH free radical of P. granatum honey between A. cerana cerana and A. mellifera ligustica

2.3.3还原力对比中、意蜂石榴蜜在0～0.50 g/mL浓度范围内的还原力,由图3可知,随着样品浓度提高,其吸光值增大,呈现良好的线性关系。对曲线进行拟合,求出吸光值在0.5时所需样品的浓度值(EC50),分别为中蜂石榴蜜0.1074 g/mL,意蜂石榴蜜0.0980 g/mL。中蜂石榴蜜的还原力略高于意蜂石榴蜜。

表3　中蜂与意蜂石榴蜜羟自由基、DPPH自由基、还原力与总酚的相关性分析

图3　中蜂与意蜂石榴蜜的还原力对比Fig.3　Reducing power of P. granatum honey between A. cerana cerana and A. mellifera ligustica

2.3.4羟自由基、DPPH自由基、还原力与总酚的相关性分析通过分析中、意蜂石榴蜜的抗氧化能力与其总酚含量之间的相关性,结果如表3所示。蜂蜜中总酚含量与羟自由基清除能力,DPPH自由基清除能力以及还原力都有良好的线性相关性。中、意蜂石榴蜜的总酚含量与还原力的相关性较为明显,相关系数分别为R2=0.9812和R2=0.9956。

3　讨论

3.1中蜂与意蜂石榴蜜理化指标差异性分析

蜜蜂通过翅膀扇风除去水分是蜂蜜酿造的重要过程,最终使成熟蜜的水分含量降至20%以下。意蜂从巢内向巢外抽风除水的效率高于中蜂从巢外向巢内鼓风的方式[12],造成中蜂蜂蜜酿造时间较长,可能促进有机酸类物质的生成,从而使得中蜂石榴蜜酸度较意蜂高。蜂箱内部温度约为30～34 ℃,中蜂酿造时间较长的特点也可能导致蜂蜜中酶活性降低,从而造成中蜂石榴蜜淀粉酶值较意蜂低。

中、意蜂石榴蜜中灰分、葡萄糖、果糖的差异可能来源于两种蜜蜂采集蜜源植物种类的差异。相对意蜂,中蜂更善于利用零星蜜源和低浓度花蜜,中蜂石榴蜜中可能混有较多蜜源植物种类的花蜜,造成两种石榴蜜中葡萄糖、果糖含量的差异。本课题组前期研究表明,在相同采集环境下,中蜂蜂蜜中的花粉浓度及种类均高于意蜂蜂蜜[13],这可能是导致中蜂石榴蜜中灰分偏高的原因。本文检测出两种石榴蜜中均含有17种氨基酸,可能来源于花粉、酶类及蜜蜂残骸等,但主要来自于哪一类还有待于进一步研究。

3.2中蜂与意蜂石榴蜜的体外抗氧化能力的差异性分析

已有研究报道,酚类化合物在蜂蜜抗氧化能力中起到主要的作用[14],这与本实验分析得到多酚含量与蜂蜜抗氧化能力有较好相关性的结论相一致。A-Rahaman等[15]研究表明,颜色深的蜂蜜较颜色浅的蜂蜜含有的总酚和总黄酮高,抗氧化能力强;这与本实验过程中发现中蜂石榴蜜颜色较意蜂石榴蜜深,其总酚含量、对羟基自由基清除力和还原力均大于意蜂石榴蜜的结果相一致。实验中所测得中蜂石榴蜜对DPPH自由基清除力低于意蜂石榴蜜,这可能是因为蜂蜜对DPPH自由基的清除力不仅与总酚含量有密切的关系,也与所含酚类化合物的结构有很大关系,并非所有的酚类化合物都具有相同的清除自由基功效[16]。

蜂蜜中的其他成分,如抗坏血酸、类胡萝卜素、多肽等物质,也会起到一定的抗氧化作用,各种抗氧化成分之间存在着协同增效作用,这些成分对抗氧化活性的贡献程度尚未明确,有必要进一步研究蜂蜜抗氧化能力与其所含抗氧化成分的内在联系。

4　结论

云南蒙自是全国石榴种植面积最大的地区之一,本研究通过对该地区中蜂和意蜂所生产的石榴蜜进行理化性质和体外抗氧化研究,结果显示:中蜂和意蜂石榴蜜之间的灰分、酸度、总酚含量、葡萄糖含量、果糖含量和淀粉酶值均存在差异性,意蜂石榴蜜的氨基酸总量及必需氨基酸含量均高于中蜂石榴蜜;中蜂石榴蜜的羟自由基清除能力和还原力均高于意蜂石榴蜜,DPPH自由基清除能力低于意蜂石榴蜜;两种石榴蜜的多酚含量和羟自由基、DPPH自由基和还原力之间均存在良好的线性关系。

[1]GB 14963-2011. 蜂蜜[S].

[2]屠振华,朱大洲,籍保平,等.红外光谱技术在蜂蜜质量检测中的研究进展[J].光谱学与光谱分析,2010,30(11):2971-2975.

[3]Alvarez-Suarez J M,Gasparrini M,Forbes-Hernandez T Y,et al. The composition and biological activity of honey:a focus on Manuka honey[J]. Foods,2014,3(3):420-432.

[4]Winston M L,Pkin J A,Taylor O R. Demography and life history characteristics of two honey bee races(Apismellifera)[J].Oecologia,1981,48(3):407-413.

[5]李绍文,孟玉萍,张宗炳,等.蜜蜂属(Apis)六个种酯酶同工酶的研究[J].北京大学学报(自然科学版),1986(4):53-57.

[6]杨冠煌.引入西方蜜蜂对中蜂的危害及生态影响[J].昆虫学报,2005,48(3):401-406.

[7]余玉生,董坤,董霞,等.石榴完全花和雄花泌蜜特点的比较[J].吉首大学学报(自然科学版),2009,30(4):104-106.

[8]Singleton V L,Rossi J A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J]. American Journal Enology and Viticulture,1965,16(3):144-158.

[9]Smirnoff N,Cumbes Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry,1989,28(4):1057-1060.

[10]Scherer R,Godoy H T. Antioxidant activity index(AAI)by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Method[J]. Food Chemistry,2009,112(3):654-658.

[11]Hao J,Kitts D D. Antioxidant activity of sugar-lysine maillard reaction products in cell free and cell culture systems[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2004,429(2):154-163.

[12]龚凫羌,宁守荣.中蜂饲养原理与方法[M].成都:四川科学技术出版社,2006:16.

[13]刘宇佳,赵风云,赵天瑞.云南中华蜜蜂与意大利蜜蜂的蜂蜜孢粉学和营养生态位[J].应用生态学报,2013,24(1):205-210.

[14]Lucía Vela,Cristina de Lorenzo,Rosa Ana Pérez. Antioxidant capacity of spanish honeys and its correlation with polyphenol content and other physicochemical properties[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2007,87(6):1069-1075.

[15]A-Rahaman N L,Chua L S,Sarmidi M R,et al. Physicochemical and radical scavenging activities of honey samples from malaysia[J]. Agricultural Sciences,2013,4(5B):46-51.

[16]徐坤,任红蕾.不同种类蜂蜜的抗氧化作用研究[J].食品工业,2008,5(5):54-57.

Comparatively study on physicochemical characteristics and antioxidant properties ofPunicagranatumhoney produced byApisceranaceracaandA.melliferaligusticain Yunnan

ZHANG Zheng1,2,3,LIU Yu-jia4,CHEN Chao2,GUO Yan2,ZHAO Feng-yun1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China; 2.Food Safety Institute,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 3.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 4.Department of Applied Chemistry,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

In the present work,the physicochemical characteristics and antioxidant properties ofPunicagranatumhoney,produced byApisceranaceracaandA.melliferaligusticain Yunnan,were investigated. The results showed that the ash,lactonic acidity,total phenol,and fructose contents inP.granatumhoney ofA.ceranaceracawere significantly higher than those in theP.granatumhoney ofA.melliferaligustica. However,glucose content,amylase,amino acid content and essential amino acid content inP.granatumhoney ofA.ceranaceracawere all significantly lower than those in theP.granatumhoney ofA.melliferaligustica. The results ofinvitroantioxidant experiments showed that the OH radical scavenging activity and reducing power ofP.granatumhoney produced byA.ceranaceracawere higher than those ofP.granatumhoney produced byA.melliferaligustica. While,the DPPH radical scavenging activity ofP.granatumhoney produced byA.ceranaceracawas weaker than that ofP.granatumhoney produced byA.melliferaligustica. Generally,in the present work,the difference betweenP.granatumhoney ofA.ceranaceracaandA.melliferaligusticawas reported for the first time,and the results might provide a theoretical basis for the development and utilization of honey in Yunnan.

Punicagranatumhoney;Apisceranaceraca;Apismelliferaligustica;physicochemical index;antioxidant activity

2015-10-19

张政(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：发酵工程，E-mail:372794280@qq.com。

赵风云(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品生物技术,E-mail:zhaofy@kmust.edu.cn。

国家自然科学基金地区基金(31560576)；云南省教育厅基金项目(2014Y080)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)10-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.017