QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中6种植物生长调节剂

周纯洁,赵　博,吴　丹,邓美林,黄思瑜

(重庆市食品药品检验检测研究院,重庆 401121)



QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中6种植物生长调节剂

周纯洁,赵博,吴丹,邓美林,黄思瑜

(重庆市食品药品检验检测研究院,重庆 401121)

为提高高沸点极性植物生长调节剂的检验效率,建立同时测定蔬菜中6种羧酸类植物生长调节剂(吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、2,4-D、α-萘乙酸、赤霉酸、4-氯苯氧乙酸)残留量的QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法。样品采用含1%乙酸的乙腈提取,无水硫酸镁-氯化钠盐析,无水硫酸镁-石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取(d-SPE)净化。液相色谱以BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)为分析色谱柱,乙腈和0.01%乙酸水溶液作流动相进行梯度洗脱。质谱分析采用电喷雾负离子电离、多反应监测模式,以基质匹配标准曲线外标法定量。6种植物生长调节剂在各自浓度范围内线性良好(r>0.99),以黄瓜和番茄为代表性基质进行3个水平加标回收实验,回收率在81.6%～108%之间,相对标准偏差(RSD)在1.3%～8.4%之间,方法检出限为0.5～6 μg/kg。该方法操作简便、耗时短、灵敏度和准确性好,可满足蔬菜中植物生长调节剂残留量的快速测定的需要。

植物生长调节剂,超高效液相色谱-串联质谱,蔬菜,QuEChERS

随着植物生长调节剂的广泛使用,其安全性受到越来越多的关注[1-2]。植物生长调节剂残留对蔬菜质量安全的影响已经逐渐引起了各国的重视,其残留限量标准也在不断被加强[3-4]。我国国家标准GB 2763《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对蔬菜中部分植物生长调节剂的残留限量进行了规定,比如,番茄中α-萘乙酸为0.1 mg/kg,几种常见蔬菜中2,4-D的残留限量在0.05～0.5 mg/kg之间。目前我国针对植物生长调节剂的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱-质谱法以及液相色谱-串联质谱法等[5-10]。液相色谱法灵敏度较低,且不能提供分析物结构方面的信息;气相色谱-质谱法在针对沸点较高、极性较大的植物生长调节剂的测定时往往需要衍生化,操作繁琐且检验周期较长;液相色谱-串联质谱法灵敏度和准确性均较高,且对于极性化合物具有良好的色谱保留能力,在高沸点极性化合物的分析方面具有独特的优势。

表1　6种植物生长调节剂的保留时间及质谱参数

注:*定量离子。

附剂时黄瓜(羧酸类植物生长调节剂(吲哚乙酸类、苯氧乙酸类、萘乙酸类、赤霉酸类等)通常具有较高的沸点和极性,且其色谱保留行为和提取试剂pH对其溶解性的影响均具有一定的相似性。因此,有必要建立一套针对蔬菜中羧酸类植物生长调节剂残留的简便、快速、准确的测定方法。本实验采用QuEChERS技术[11-13]对样品进行前处理,建立同时检测蔬菜中6种羧酸类植物生长调节剂的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法,对色谱条件和样品前处理过程进行了优化,以期得到简便快速,回收率、灵敏度和重现性均能满足日常检测要求的羧酸类植物生长调节剂的检测方法。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

α-萘乙酸、2,4-D、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸和4-氯苯氧乙酸纯度均>98%,购于Dr. Ehrenstorfer公司;赤霉酸纯度>99%,J&K Scientific公司;无水硫酸镁和氯化钠均为分析纯,购于成都市科龙化工试剂厂;无水乙酸钠分析纯,天津市大茂化工试剂厂;C18粉和PSA购于Welch公司;GCB购于Supelco公司;乙酸铵色谱纯,CNW公司;乙酸色谱纯,Thermo-Fisher公司;甲酸色谱纯,ACS公司;乙腈色谱纯,Merck公司;实验用水超纯水;蔬菜样品黄瓜、番茄、四季豆、莴笋、油麦菜、白菜市售。

API 4000型三重四级杆质谱(配电喷雾离子源)AB SCIEX公司;ACQUITY超高效液相色谱仪Waters公司;VORTEX GENIUS 3型旋涡振荡器IKA公司;CF15RXⅡ型高速冷冻离心机HITACHI公司。

1.2实验方法

1.2.1标准溶液的配制分别准确称取6种植物生长调节剂(α-萘乙酸、2,4-D、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、4-氯苯氧乙酸、赤霉酸)标准品,用甲醇配成浓度各为1 mg/mL的标准储备液,-18 ℃储存,有效期3个月。

1.2.2样品前处理提取:准确称取5 g(精确至0.01 g)已均质的蔬菜样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL含1%乙酸的乙腈,涡旋1 min混匀。

分配:加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠的混合粉末,迅速振摇,涡旋振荡1 min,以4000 r/min离心5 min。

净化:转移2 mL上清液至装有200 mg无水硫酸镁和10 mg石墨化炭黑(GCB)的具塞离心管中,涡旋混合1 min,以10000 r/min离心2 min。取上清液过0.22 μm有机系滤膜,待测。

1.2.3仪器条件ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:A为乙腈,B为0.01%乙酸水溶液;柱温40 ℃;流速0.4 mL/min;进样量5 μL;梯度洗脱程序:0～0.5 min,10% A;0.5～1.5 min,10% A～95% A;1.5～3.0 min,95% A;3.0～4.0 min,95% A～10% A。

质谱条件:电喷雾离子源,负离子模式(ESI-),多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS):-4500 V;离子源温度:550 ℃;雾化气(GS1):2.8×105Pa;辅助气(GS2):3.5×105Pa;气帘气(CUR):2.1×105Pa;定性离子对、定量离子对、去簇电压(Declustering potential)和碰撞能(Collision energy)见表1。

1.3数据处理

用空白样品基质溶液将标准储备液稀释得到不同浓度的基质混合标准工作溶液,按1.2.3所述方法测定。采用Analyst® 1.5.2软件进行数据处理,得到基质匹配标准曲线,外标法定量。

2　结果与讨论

2.1流动相的选择

首先考察了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相时,6种植物生长调节剂混合标准溶液的分离效果。实验发现,乙腈-水作为流动相时，赤霉酸和4-氯苯氧乙酸在色谱柱上的保留时间分别为0.75 min和0.77 min，保留效果较差，乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液作流动相时，两种化合物的保留时间分别为1.35 min和1.58 min，而乙腈-0.1%甲酸水溶液作流动相时，保留效果较好，两种化合物保留时间分别为1.63 min和1.86 min，但其它4种化合物响应值均有不同程度的降低,见图1。该结果表明,流动相中甲酸的引入有利于化合物在色谱柱上的保留,但由于质谱采用的是电喷雾电离负离子模式采集数据,甲酸的引入大大降低了各化合物的离子化效率。因此,考虑采用乙腈-乙酸水溶液作流动相。

图1　不同流动相时6种植物生长调节剂的相对峰面积Fig.1　Relative peak area of 6 plant growth regulators using different mobile phase

由于α-萘乙酸和4-氯苯氧乙酸在m/z 184.7/140.8离子对监测时均有响应,4-氯苯氧乙酸保留时间变大可能导致其与α-萘乙酸的色谱峰发生重叠,影响分离效果,本实验还对流动相中乙酸的浓度进行了优化。图2为乙腈-水、乙腈-0.001%乙酸水溶液、乙腈-0.01%乙酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液作流动相时m/z 184.7/140.8离子对的色谱图。图2表明,随着乙酸浓度的增大,4-氯苯氧乙酸的保留时间逐渐变大,但采用乙腈-0.1%乙酸水溶液作流动相时,α-萘乙酸和4-氯苯氧乙酸已无法实现基线分离。因此,本实验选择乙腈-0.01%乙酸水溶液作流动相,可兼顾各化合物的质谱响应及色谱保留效果。

图2　不同乙酸水溶液作为流动相时m/z 184.7/140.8离子对的色谱图Fig.2　Chromatogram of ion pair m/z 184.7/140.8 using an aqueous phase containing acetic acid注:(A)0%,(B)0.001%,(C)0.01%,(D)0.1%。

2.2QuEChERS样品前处理条件的优化

2.2.1提取剂的选择6种植物生长调节剂在水中溶解性均较小,因此本实验采用有机溶剂作为提取剂。由于蔬菜中通常含有大量的色素,若采用非极性有机溶剂容易将色素同时提取出来,所以考虑采用乙腈提取。乙腈对于不同极性的物质均有一定的溶解能力,且所提取的色素等干扰物质较少,满足多种物质同时检测时提取剂的要求[14]。考虑到待测化合物分子结构中均含有羧基,乙酸的加入有利于其存在形态从离子态向分子态转变,从而增加其在乙腈中的溶解度,以增加乙腈的提取效率。实验分别考察了用乙腈和1%乙酸乙腈作为提取剂时,各化合物的回收率结果见表2,发现乙酸的加入对赤霉酸的提取效率影响较大,其回收率可由35%提高到90%。因此,实验选择用1%乙酸乙腈作为提取剂。

表2　不同提取剂提取时6种植物生长调节剂的加标回收率(50 μg/kg)

2.2.2分配剂的选择QuEChERS方法主要包括提取、分配和净化三部分,其中分配步骤中加入的盐可以促使有机相与水相分层,降低待测物在水相中的溶解度,并除去提取液中的水分。本实验分别考察了加入无水硫酸镁-氯化钠和无水硫酸镁-无水乙酸钠时各化合物的回收率。结果见图3,表明采用无水硫酸镁-无水乙酸钠体系作为分配剂时,6种化合物的回收率均较低。这可能是由于缓冲体系的使用使提取液中杂质增多,且弱碱性乙酸钠的引入抑制了各化合物由离子态向分子态的转变所致。因此,实验选择在提取步骤中加入无水硫酸镁-氯化钠作为分配剂。

图3　不同分配剂时黄瓜(A)和番茄(B)中6种化合物的加标回收率(50 μg/kg)Fig.3　The recoveries of 6 plant growth regulators (spiked 50 μg/kg)in cucumber(A)and tomato(B) using different distribution agents

2.2.3吸附剂的选择与传统的固相萃取方法不同,QuEChERS技术是将适量的吸附剂直接作用于提取液中,以除去样品提取液中大部分杂质。常用的吸附剂主要有乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18粉等。PSA可以有效去除提取液中的脂肪酸和糖类的干扰,GCB主要用于去除色素的干扰,而C18粉具有良好的脱脂能力[15]。本实验考察了无水硫酸镁+PSA、无水硫酸镁+C18粉和无水硫酸镁+GCB的净化效果,结果表明,GCB可以有效去除提取液中的色素,但C18粉和PSA脱色效果不明显,提取液和净化液颜色差异很小。如图4所示,当采用无水硫酸镁+PSA作为吸附剂时,赤霉酸、2,4-D和4-氯苯氧乙酸的回收率明显降低;而采用无水硫酸镁+C18粉作为吸附剂时,吲哚-3-丁酸的回收率相对较低。虽然GCB对吲哚-3-丁酸也有一定的吸附作用,但为了有效去除提取液中大量的色素,延长色谱柱的使用寿命,本实验选择无水硫酸镁+GCB作为吸附剂。由于GCB的用量与其吸附能力相关,本实验还对GCB的加入量进行了优化,当加入1.25 mg/mL GCB时,脱色效果较差;随着GCB加入量的增加,脱色效果逐渐增强,当加到5 mg/mL GCB以上时,提取液中的色素脱除效果比较理想,净化后溶液呈淡黄色。继续增加GCB的用量,虽然脱色效果更好,但各化合物的回收率明显降低。如图5所示,当加入10 mg/mL以上的GCB时吲哚-3-丁酸、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、α-萘乙酸和吲哚-3-乙酸的回收率逐渐降低,因此本实验吸附剂GCB的用量选择5 mg/mL。

图4　加入不同吸附剂时黄瓜(A)和番茄(B)中6种化合物的加标回收率(50 μg/kg)Fig.4　The recoveries of 6 plant growth regulators(spiked 50 μg/kg)in cucumber(A)and tomato(B) when adding different sorbents

图5　加入不同量GCB作为吸附剂时黄瓜(A)和番茄(B)中6种化合物的加标回收率(50 μg/kg)Fig.5　The recoveries of 6 plant growth regulators (spiked 50 μg/kg)in cucumber(A) and tomato(B)when adding different quantities of GCB as sorbents

2.3线性方程、方法检出限及定量限

取阴性蔬菜样品,按照1.2.2步骤进行样品前处理得到空白基质溶液,配制6种化合物的标准系列工作溶液,以峰面积(Y)对质量浓度(X)进行线性回归分析,这6种化合物在相应的质量浓度范围内线性关系良好,线性相关系数(r)均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)浓度估算方法检出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)所对应浓度作为方法定量限(LOQ),6种植物生长调节剂方法检出限在0.5～6 μg/kg之间,方法定量限在1.5～18 μg/kg之间,见表3。

表3　6种化合物的线性范围、回归方程、方法检出限和定量限

表4　6种植物生长调节剂的平均回收率和相对标准偏差(n=6)

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2.4方法回收率和精密度

以黄瓜和番茄为代表基质,进行添加回收和精密度实验。3个添加水平的回收率为81.6%～108%,相对标准偏差(RSD)均不大于8.4%,见表4。

2.5实际样品测定

将该方法分别应用于黄瓜、番茄、四季豆、莴笋、油麦菜、白菜6种蔬菜25批次样品的检测,结果在3批次四季豆和1批次白菜中检出吲哚-3-乙酸,浓度在10.2～17.2 μg/kg之间;在3批次四季豆中检出赤霉酸,浓度在8.0 μg/kg～17.1 μg/kg之间;在1批次番茄中检出7.6 μg/kg的2,4-D,低于GB 2763《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对番茄中2,4-D的限量要求(0.5 mg/kg)。

3　结论

本实验采用QuEChERS样品前处理技术,建立了同时测定蔬菜中6种羧酸类植物生长调节剂的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品采用含1%乙酸的乙腈提取,无水硫酸镁-氯化钠盐析,无水硫酸镁-石墨化炭黑(GCB)分散固相萃取(d-SPE)净化。液相色谱以C18柱为分析色谱柱,乙腈和0.01%乙酸水溶液作流动相进行梯度洗脱。质谱分析采用电喷雾负离子电离、多反应监测模式,以基质匹配标准曲线外标法定量。6种植物生长调节剂在各自浓度范围内线性良好,线性相关系数(r)均大于0.99,以黄瓜和番茄为代表性基质进行三水平加标回收实验,获得了理想的回收率(81.6%～108%),相对标准偏差(RSD)在1.3%～8.4%之间。本方法简便快速,灵敏度和准确性高,应用于日常检测可以缩短检测周期,降低检测成本,对于蔬菜中植物生长调节剂残留检测具有重要意义。

表5　蔬菜中植物生长调节剂检出情况

注:“ND”代表未检出。

Determination of six plant growth regulators in vegetables by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Chun-jie,ZHAO Bo,WU Dan,DENG Mei-lin,HUANG Si-yu

(Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing 401121,China)

To improve the detection efficiency of polar plant growth regulators with high boiling point,a new method for the simultaneous determination of 6 carboxyl-contained plant growth regulators(indole-3-acetic acid,indole-3-butyric acid,2,4-D,α-naphthaleneacetic acid,gibberellic acid and 4-chlorophenoxyacetic acid)residues in vegetables was developed by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The analytes were extracted with acetonitrile containing 1% acetic acid,and salted out with anhydrous magnesium-sodium chloride. The extracts were cleaned up by dispersive solid phase extraction(d-SPE)using anhydrous magnesium-graphitized carbon black(GCB)as sorbents. Chromatographic analysis was carried out on BEH C18column(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)using a mobile phase comprised of acetonitrile and water(containing 0.01% acetic acid)in gradient program. The plant growth regulators were analyzed by negative electrosprary ionization(ESI-)tandem mass spectrometry under multiple reaction monitoring(MRM)mode. Quantification was achieved using matrix-matched external standard method. The calibration curves showed good linearity in each concentration range,and the recoveries of the 6 plant growth regulators spiked at three levels in cucumber and tomato were between 81.6% and 108%,with the relative standard deviation(RSD)ranging from 1.3% to 8.4%. The limits of detection(LODs)in vegetables were in the range of 0.5 μg/kg and 6 μg/kg. The method is simple,convenient,time-saving,sensitive and accurate,and suitable for the rapid determination of plant growth regulators residues in vegetables.

plant growth regulators;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);vegetables;QuEChERS

2015-10-19

周纯洁(1985-)，女，博士，工程师，研究方向：食品安全检测，E-mail:chunjie_45@163.com。

重庆市应用开发计划项目(cstc2013yykfB80016)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)10-0094-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.009