阿魏菇多糖超声微波辅助提取及其抗氧化活性

李三省，张伟丰，王亮，*，陈义勇（.昌吉州产品质量检验所，新疆昌吉800；.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐80046；.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟5500）

阿魏菇多糖超声微波辅助提取及其抗氧化活性

李三省1，张伟丰2，王亮2，*，陈义勇3
（1.昌吉州产品质量检验所，新疆昌吉831100；2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐830046；3.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500）

以阿魏菇作为原料，水作为提取溶剂，通过响应面优化超声-微波协同辅助提取阿魏菇多糖工艺，并和传统水浴浸提法进行比较，采用清除DPPH·、·OH和O2-·模型对其体外抗氧化活性进行评价。结果表明：超声-微波辅助提取阿魏菇多糖的最佳的工艺条件为：料液比1∶50（g/mL），提取时间10min，微波功率60W。与传统水浴浸提法相比，超声-微波辅助提取缩短了提取时间，阿魏菇多糖的得率由2.23%增加到5.6%。超声-微波协同辅助提取对阿魏菇多糖的结构基本没有影响。阿魏菇多糖具有较强的清除DPPH·、·OH和O2-·的能力，并与质量浓度呈一定正相关关系，当阿魏菇多糖质量浓度达到5mg/mL时，对DPPH·、·OH和O2-·的清除率分别达到67%、59%和63%，但弱于VC的抗氧化活性。关键词：超声-微波协同辅助提取；阿魏菇多糖；抗氧化

因此本文将超声和微波提取技术结合起来，充分利用超声和微波提取技术的优点，探讨超声-微波协同辅助技术（Ultrasonic microwave assisted extraction，UMAE）提取阿魏菇多糖的最佳工艺，并和传统水浴浸提（Traditional warer bath extraction，TWBE）进行比较，同时探讨阿魏菇多糖的抗氧化活性，旨在为阿魏菇多糖的工业化生产提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

阿魏菇（购自乌鲁木齐南山），经新疆大学生命科学与技术学院微生物教研室鉴定为阿魏菇子实体。乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等均为分析纯。

CW-2000超声-微波协同萃取仪：上海新拓微波溶样测试技术有限公司；EZ-DRY冷冻干燥仪：美国FTS公司；Nicolet Nexus傅里叶红外光谱仪：Thermo Electron公司；SHB-B循环水式真空泵：郑州长城科工贸公司；RE－52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；DJ-04粉碎机：上海淀久中药机械制造有限公司；UV-2000紫外可见分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：长沙湘仪离心机有限公司。

1.2方法

1.2.1阿魏菇多糖超声-微波协同辅助提取

新鲜阿魏菇在50℃条件下真空干燥后粉碎，过80目筛，将阿魏菇粉置于超声-微波萃取仪250 mL玻璃萃取容器中，固定超声功率50 W，以水作为萃取溶剂，在一定的萃取时间和微波功率条件下提取阿魏菇多糖，萃取完成后冷却，离心（1 000 r/min，15 min）得到上清液，将上清液浓缩后，按体积比1∶4加入95%乙醇，4℃条件下过夜，弃去上层液体，将沉淀冷冻干燥得到阿魏菇多糖。

1.2.2阿魏菇多糖含量测定及得率计算

阿魏菇多糖含量测定采用苯酚-硫酸法［7］，得率按下列公式计算：

阿魏菇多糖得率/%=多糖质量/原料质量×100

1.2.3传统水浴浸提法与超声-微波辅助提取的比较

1.2.3.1得率的比较

分别在两种提取方法的最优工艺条件下提取阿魏菇多糖，平行提取3次，分别测定多糖得率，然后取平均值。

1.2.3.2红外光谱分析

分别取超声-微波协同辅助提取和传统水浸提法两种提取方法所得的阿魏菇多糖1 mg，KBr研磨压片，采用Nicolet Nexus FT-IR于4 000 cm-1～400 cm-1范围内进行扫描，分辩率为4 cm-1。

1.2.4阿魏菇多糖的抗氧化活性

1.2.4.1羟基自由基（·OH）清除能力的测定［8］

加入不同质量浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）1 mL的阿魏菇多糖溶液置于不同烧杯中，然后分别加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL，最后加入8.8mmol/LH2O21mL启动反应，37℃反应0.5h，以蒸馏水为参比，在510 nm下测量各浓度的吸光度。考虑到多糖本身的吸光值，以9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水杨酸-乙酸1 mL、不同浓度的多糖溶液1mL 和1 mL蒸馏水做为多糖的本底吸收值。每个质量浓度做3个平行管，结果取平均值。根据公式（1）计算羟基自由基（·OH）清除率，按上述步骤测定抗坏血酸对羟自由基的清除率。

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入多糖溶液后的吸光度；Ax0为不加显色剂H2O2多糖溶液本底吸光度。

1.2.4.2清除超氧阴离子自由基（O2-·）的测定［9］

加入不同质量浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）1 mL的阿魏菇多糖溶液5 mL置于不同烧杯中，空白组、自氧化组分别加入5 mL蒸馏水，然后分别加入50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.2）4.5 mL，混匀后在25℃水浴中保温20 min，取出后样品组和自氧化组立即加入在25℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl配制），空白组加0.3 mL 10 mmol/L HCl溶液，迅速摇匀后倒入比色杯，325 nm下每隔30秒测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的变化率，并与空白液比较，根据公式（2）计算超氧阴离子自由基（O2-·）清除率，按照上述步骤测定抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除率。

式中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化速率；ΔA为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率；单位均为吸光度每分钟的增值。

1.2.4.3清除DPPH自由基的测定［10］

准确移取2 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L），加入2 mL不同质量浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）的多糖样品溶液，混匀，黑暗中放置30 min后，517 nm波长处测吸光度。以95%乙醇为空白，测定2.0 mL多糖溶液与2.0 mL DPPH溶液吸光度值Ai，测定2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL 60%乙醇吸光度值A0以及2.0 mL多糖溶液与2.0 mL 60%乙醇混合液吸光度值Aj。按式（3）计算DPPH自由基清除率，按照上述步骤测定抗坏血酸对DPPH自由基的清除率。

式中：A0为乙醇加DPPH溶液的吸光度；Ai为多糖加DPPH溶液的吸光度；Aj为多糖加乙醇的吸光度。

2　结果与分析

2.1超声-微波协同辅助提取阿魏菇多糖工艺参数的优化

在单因素试验的基础上，以微波功率、提取时间和料液比作为主要因素，以阿魏菇多糖得率作为响应值，设计三因素三水平的二次回归方程来拟合因素和指标（响应值）之间的函数关系，确定阿魏菇多糖提取的工艺参数。根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，分别用X1、X2、X3表示料液比、提取时间和微波功率，按方程Xi=（Xi-X0）/ΔX对自变量进行编码。以阿魏菇多糖得率为响应值（Y），每一自变量的低、中、高实验水平分别以－1、0、+1进行编码。因素编码及自变量水平见表1，试验结果见表2。

表1　超声-微波提取阿魏菇多糖提物工艺条件的因素编码Table 1　The encoding values of the factors of the process conditions of extracting PFP by UMAE

表2　Box-Behnken设计方案及试验结果Table 2　Box-Behnken design and results

续表2　Box-Behnken设计方案及试验结果Continue table 2　Box-Behnken design and results

应用Design-Expert 8.06软件对表2中的数据进行多元回归拟合和回归方差分析，结果见表3。

表3　回归方程的方差分析Table 3　Analysis of variance of the regression equation

料液比（X1）、提取时间（X2）、功率（X3）多糖得率

用确立的回归方程来预测模型，结果表明多糖得率回归方程的相关系数R2值达到了0.929 9，由P值可知，模型具有显著性（P=0.002 8），方程的回归模型失拟项P值为0.750 5，无显著性影响，说明数据没有异常点，模型适当。该回归方程能够较好地描述因素与得率之间的真实关系，可以用来预测最佳提取工艺条件。

根据所建立的数学模型，优化得到最佳条件为：料液比为1∶52.04（g/mL），提取时间为9.82 min，微波功率为61 W，得率为5.89%。结合实际，将参数修正在优化参数附近，最终确定最佳工艺条件为：料液比1∶50（g/mL），提取时间10 min，微波功率60 W。在此条件下阿魏菇多糖理论得率为5.38%。采用上述最优条件进行阿魏菇多糖提取试验，进行验证试验，平行3次试验取平均值，实际测得的多糖得率为5.6%，与预测值无显著差异，说明响应面法优化得到的工艺条件参数准确可靠，具有一定的实践价值。

2.2传统水浴浸提法与超声-微波协同提取法的比较

2.2.1得率的比较

在预试验及正交试验的基础上，得出水浴提取阿魏菇多糖的最佳条件：提取温度为70℃，时间4 h，料液比1∶40（g/mL），分别在超声-微波辅助提取最佳工艺［料液比1∶50（g/mL），时间10 min，功率60 W］。和传统水浴最佳条件进行3次阿魏菇多糖的提取试验，然后取平均值，比较传统水浴法与超声-微波辅助提取法对阿魏菇多糖得率的影响，结果见表4。

表4　不同提取方法对阿魏菇多糖得率的影响Table 4　Effect of different methods on the yield of PFP

从表4可以看出：超声-微波辅助提取阿魏菇多糖的得率明显高于水浴浸提法，得率由2.23%增加到5.6%，原因是微波升温快速、萃取效率高，超声波具有机械振动作用和空化作用，可以有效的破坏细胞壁结构［11］，从而使阿魏菇细胞内的多糖更多的释放，从而提高多糖得率。

2.2.2红外光谱的比较

为了比较传统水浴浸提与超声-微波协同辅助提取对阿魏菇多糖重要基团的影响，对两种方法提取的阿魏菇多糖进行红外光谱分析，结果见图1。

图1　 红外光谱对比图Fig.1　Comparison of infrared spectra of PFP

从图1可以看出：在3 340.1 cm-1及附近出现的宽峰是糖分子内或分子间氢键O-H伸缩振动峰，在2 750 cm-1～3 000 cm-1出现一个弱峰是次甲基（-CH2-）中的C-H的伸缩振动的吸收峰，在1 024.2 cm-1及附近出现的吸收峰是由糖环上C-O伸缩振动所引起的，两种方法所得的阿魏菇多糖的峰形位置基本相同，表明超声-微波协同辅助提取对阿魏菇多糖的结构基本没有影响。

2.3阿魏菇多糖的抗氧化活性

阿魏菇多糖的抗氧化活性结果见图2。

图2　阿魏菇多糖的抗氧化活性Fig.2　Antioxidant activity of PFP

从图2可以看出，阿魏菇多糖具有较强的清除DPPH·、·OH和O2-·的能力，并与质量浓度呈一定正相关关系，当阿魏菇多糖质量浓度达到5 mg/mL时，对DPPH·、·OH和O2-·的清除率分别达到67%、59%和63%，但弱于VC的抗氧化活性。

3　结论

1）确定超声-微波辅助提取阿魏菇多糖的最佳的工艺条件为：料液比1∶50（g/mL），提取时间10 min，微波功率60 W，在此条件下阿魏菇多糖得率为5.6%。

2）与传统水浴浸提法相比，超声-微波辅助提取阿魏菇多糖缩短了提取时间，阿魏菇多糖的得率由2.23%增加到5.6%。

3）红外光谱分析表明超声-微波协同辅助提取对阿魏菇多糖的结构基本没有影响。

4）阿魏菇多糖具有较强的清除DPPH·、·OH和O2-·的能力，并与质量浓度呈一定正相关关系，当阿魏菇多糖质量浓度达到5 mg/mL时，对DPPH·、·OH和O2-·的清除率分别达到67%、59%和63%，但弱于VC的抗氧化活性。

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Ultrasonic Microwave Assisted Extraction Technology of Polysaccharides from Pleurotus ferulae and Its Antioxidant Activity

LI San-sheng1，ZHANG Wei-feng2，WANG Liang2，*，CHEN Yi-yong3
（1.Changji Institute of Product Quality Inspection，Changji 831100，Xinjiang，China；2.School of College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China；3.School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Pleurotus ferulae was used as raw material.Water was used as extraction solvent.Ultrasonic microwave assisted extraction（UMAE）technology of polysaccharides from Pleurotus ferulae（PFP）was optimized by response surface methodology.The traditional water bath extraction（TWBE）was compared with UMAE.Antioxidant activity of PFP in vitro was evaluated by hydroxyl，superoxide anion and DPPH free radical scavenging method The optimum technology condition for ultrasonic microwave assisted extraction of PFP was determined as follows：the material-liquid ratio was 1∶50（g/mL），the extraction time was 10 min and microwave power was 60 W.Compared with the traditional water bath extraction，the ultrasonic microwave assisted extraction was time saving and increased the yield from 2.23%to 5.6%.UMAE had no effect basically on structure of PFP.PFP had strong scavenging effects of DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical.Scavenging effects had the positive correlation with the concentration.when concentration of PFP reached 5 mg/mL，scavenging rate of DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical was 67%，59%and 63%，respectively.However，Antioxidant activity of PFP was week compared with VC.

ultrasonicmicrowaveassistedextraction；polysaccharidesfromPleurotusferulae；antioxidant阿魏菇（Pleurotus ferulae）又名阿魏侧耳、阿魏蘑，因其生长在新疆干旱草原上的草本植物阿魏上而得名。其子实体具有很高的营养价值和药用价值［1］。研究发现阿魏菇多糖（polysaccharides from Pleurotus ferulae，PFP）具有增强免疫力［2］、抗炎［3］等功效。近年来，超声和微波辅助萃取技术广泛应用于植物有效成分的提取，微波作为一种电磁能，具有提取时间短的特点。超声波作为弹性介质中的一种机械波，具有快捷、能耗低、不破坏有效成份、提取效率高的特点［4］。目前阿魏菇多糖的提取方法主要有传统水浴浸提法［5］、超声波法［6］，但是应用超声-微波辅助技术提取阿魏菇多糖的研究鲜见报道。

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.017

2013年新疆维吾尔自治区科技支疆项目计划（指令性）项目（2013911071）

李三省（1964—），男（汉），高级工程师，本科，研究方向：化工产品的质量检验。

2015-07-18