葛根与地龙联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制探讨

徐文强，杨莹，彭井华，陈贞月，王占坤，马双双，宋小莉

(山东中医药大学，济南 250355)



葛根与地龙联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制探讨

徐文强，杨莹，彭井华，陈贞月，王占坤，马双双，宋小莉

(山东中医药大学，济南 250355)

目的观察葛根与地龙联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用，并探讨其可能机制。方法106只Wistar大鼠随机分为7组，A组以0.787 5 g/kg葛根+0.525 g/kg地龙灌胃，B组予1.575 g/kg葛根+1.05 g/kg地龙，C组予1.575 g/kg葛根，D组予1.05 g/kg地龙，E组予6.3 mg/kg尼莫地平片，F、G组均予0.9%生理盐水10 mL/kg。连续给药14 d后，A、B、C、D、E、F组均制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，G组除不插栓线外，全过程同其他组。计算各组脑组织脑梗死体积，采用水溶性四氮唑法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法检测血清丙二醛(MDA)，比色法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)。结果与G组比较，F组脑梗死体积增加，血清SOD活性降低，LDH、MDA含量升高；与F组比较，A、B、C、D、E组脑梗死体积减少，B组血清SOD活性升高及LDH、MDA含量降低；与C组比较，B组脑梗死体积减少，血清SOD活性升高，LDH、MDA含量降低；与D组比较，A、B组脑梗死体积减少，血清SOD活性升高，MDA含量降低。结论葛根与地龙联合应用可有效预防大鼠脑缺血再灌注损伤，尤以高剂量葛根、地龙联合应用效果更佳，其机制可能与增加血清SOD活性及降低LDH、MDA含量有关。

葛根；地龙；脑缺血再灌注损伤；动物实验

缺血性脑血管疾病是人类致残和致死的主要病因之一，其发病率逐年升高，患病人群也有年轻化趋势。积极寻找新的抗脑缺血药物、提高现有药物的临床疗效是目前亟待解决的难题。在中药归经理论中，引经药可以引导与之配伍的其他药物达于病所，从而提高疗效[1]。葛根为阳明经的引经药，能升阳明清气、引药上行。文献[2～4]报道，针刺阳明经腧穴可改善脑卒中患者运动功能，明显改善患者血液流变学指标，疗效显著。因此，通过配伍引药葛根，借助其引经报使作用，对于提高抗脑缺血药物的疗效具有重要的意义。本研究观察了葛根与地龙联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用，并探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物、药品与试剂SPF级Wistar大鼠106只，雌雄各半，体质量280～300 g，由山东鲁抗医药股份有限公司提供。地龙、葛根(山东中医药大学附属医院)，尼莫地平(山东新华制药股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，TTC染色试剂、PBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2实验动物分组及葛根、地龙用法健康Wistar大鼠106只，实验条件下适应性喂养7 d后，随机分为7组，A、B、C、D、E、F组各16只，G组10只。A组大鼠以0.787 5 g/kg葛根+0.525 g/kg地龙灌胃，B组予1.575 g/kg葛根+1.05 g/kg地龙，C组予1.575 g/kg葛根，D组予1.05 g/kg地龙，E组予6.3 mg/kg尼莫地平片，F、G组均予0.9%生理盐水10 mL/kg。

1.3脑缺血再灌注损伤模型制备连续给药14 d后，各组大鼠均经1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔麻醉后，分离颈总动脉及颈内动脉、颈外动脉。G组不进行任何操作，缝合伤口；其余各组均采用大脑中动脉线栓法[5]建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型，即结扎颈总动脉以及颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉下穿线备用，在颈总动脉作一切口，将栓线从切口插入到颈内动脉，松开动脉夹，插入18～20 mm遇到阻力即可用备用穿线固定，缝合伤口后，将大鼠放入笼中，并采取保温措施。缺血2 h将栓线拔离动脉分叉口。再灌注24 h后参照文献[6]方法进行五分制标准评分，无神经功能缺损症状计0分，不能完全伸展右侧前肢计1分，向右侧旋转计2分，向右侧倾倒计3分，不能自发行走、意识障碍计4分，去除评分为0分和4分的大鼠。

1.4大鼠脑组织脑梗死体积测算脑缺血2 h再灌注24 h后，各组大鼠麻醉后断头取脑，于-20 ℃冰箱中速冻20 min，将鼠脑切成5片，隔2 mm切一片。将切片置于2%TTC中，用锡箔纸盖住后，放入37 ℃温箱15～30 min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。用Image pro plus6.0测得梗死面积，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2 mm)为总的梗死体积，结果以梗死灶体积占全脑体积的百分率表示。

1.5大鼠血清SOD活性及MDA、LDH含量检测缺血再灌注24 h后，大鼠腹主动脉取血5 mL。3 500 r/min离心10 min，取上清液，采用水溶性四氮唑法检测血清SOD活性，硫代巴比妥酸法测定血清MDA，比色法测定血清LDH，操作按试剂盒说明书进行。

2　结果

2.1各组大鼠脑梗死体积比较去除神经功能学评分为0分和4分的大鼠以及在饲养过程中死亡的大鼠，每组样本数为8只。A、B、C、D、E、F、G组大鼠闹梗死体积分别为15.660 0%±5.901 6%、13.160 0%±7.581 9%、24.760 0%±7.669 4%、20.760 0%±7.969 9%、27.760 0%±6.193 0%、35.570 0%±3.959 1%，F组与G组比较，A、B、C、D、E组与F组比较，A、B组与C组比较，B组与D组比较，P均<0.05。

2.2各组大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量比较大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量比较见表1。

表1　　　　各组大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量

注：与G组比较，*P<0.01；与F组比较，ΔP<0.05；与C组比较，★P<0.05；与D组比较，#P<0.05。

3　讨论

脑血管病是目前公认的三大死亡原因之一，在我国脑血管病的病死率仅次于恶性肿瘤[7]。脑缺血占脑血管病的80%～85%，临床上一般用溶栓治疗来解除梗塞,建立缺血区域血流再灌注，让缺血组织和器官重新获得氧、营养物质，并清除有害的代谢产物。然而，近年研究发现[8]，及时恢复血液再灌注虽有利于减轻缺血损伤，使某些可逆性损伤在功能上获得恢复，但缺血后恢复血流也有其不利的一面，如某些情况下出现能导致组织损伤和功能障碍进一步加重的再灌注损伤。因此，寻找有效的预防脑缺血再灌注损伤的神经保护药物、提高药物疗效、减少不良反应是目前抗脑缺血药物研究的热点。

引经是在中医药学归经与配伍理论基础上，经过长期临床实践总结出的用药经验。引经药指药物对某些脏腑经络有特殊的亲和作用，因而对这些部位的病变具有主要或者特殊的治疗作用。古人云：“引经之药，剂中用为向导，则能接引众药，直入本经，用力寡而获效捷也。”利用引经药可引导相应中药以及靶向药物进入病所病灶来扶正祛邪。临床上常用的引经药有葛根、柴胡、桔梗等。葛根，为豆科植物野葛的干燥根，习称野葛，有解肌退热、透疹、生津止渴、升举清阳之功。葛根是临床预防心脑血管疾病的常用药物，且实验研究也证实其抗脑缺血的药理作用[9,10]。葛根是阳明胃经的引经药，实验研究[11]表明随着葛根浓度的升高，食管癌细胞水通蛋白1表达也上调，可使其他药物容易进入靶部位来增强疗效，发挥治疗作用。

地龙是我国重要的中药材之一，李时珍在《本草纲目》称之具有通经活络、活血化瘀等作用。文献[12,13]报道，地龙可以提高脑缺血再灌注损伤后脑组织SOD、GSH-PX活性，降低Caspase-3活性，清除自由基、炎症细胞因子、减轻氧应激损伤及抗神经细胞凋亡等作用。本研究显示，B组SOD活性增加，MDA、LDH含量降低，相对梗死体积最小，且较单用地龙或葛根效果好，说明地龙与引经药葛根配伍具有协同作用。虽然A组各指标与其他组的差异不如B组，但仍优于单药组。提示通过两药联合应用，能更加有效地清除机体内氧自由基，避免细胞氧化性损伤，减少脑组织缺血性损害，降低脑部细胞的损伤程度。这可能与葛根引药效入阳明经，引导地龙药效的充分发挥有关。因此，通过对地龙与引经药葛根合用的药理作用研究，为现代临床应用引经理论预防脑缺血再灌注损伤提供一种重要思路与依据。

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山东省高等学校科技计划项目(J13LK52)；山东中医药大学2015年度国家级大学生研究训练计划(SRT)项目(201510441076)。

杨莹(E-mail: yangying2245@126.com)，宋 小 莉(E-mail: sxlbwd@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.013

R743.31

A

1002-266X(2016)15-0041-03

2015-12-03)