安定对高皮质激素血症小鼠绝望样行为的改善作用及其机制探讨

邵靖，戴建国，马健

(南京中医药大学基础医学院，南京 210023)



·基础研究·

安定对高皮质激素血症小鼠绝望样行为的改善作用及其机制探讨

邵靖，戴建国，马健

(南京中医药大学基础医学院，南京 210023)

目的观察安定对高皮质激素血症小鼠绝望样行为的改善作用，并探讨其可能机制。方法将50只C57BL/6N小鼠随机分为A、B、C、D、E组各10只，A、B、C、D组均制备高皮质激素血症模型，E组不作任何处理。制模后，D、E组以蒸馏水灌胃，A、B、C组分别以0.1 mg/kg安定、0.2 mg/kg安定、3.6 mg/kg盐酸氟西汀灌胃，1次/d，连续4周。观察各组小鼠绝望样行为(悬尾不动时间、游泳不动时间)，Western blotting法检测海马组织神经微丝蛋白轻链(NF-L)和突触素(SYP)。结果与E组比较，D组悬尾不动时间短，游泳不动时间长；与D组比较，A、B、C组悬尾不动时间长，游泳不动时间短；P均<0.05。与E组比较，D组NF-L、SYP相对表达量降低；与D组比较，A、B、C组的NF-L、SYP相对表达量升高；P均<0.05。结论安定可改善高皮质激素血症小鼠绝望样行为，其机制可能与上调NF-L、SYP表达有关。

安定；高皮质激素血症；绝望样行为；神经微丝蛋白轻链；突触素

高皮质激素血症患者因多种原因导致血浆皮质激素水平升高，常与精神压力过大所致长期慢性应激，或临床应用皮质激素导致的血浆皮质激素水平上升有关，可引起焦虑、抑郁等临床症状[1]。长时间血浆中皮质激素维持在一定的高水平，可导致抑郁症，对人体神经系统有严重损害，甚至可致神经元死亡。迄今尚未发现能对抗高皮质激素血症致神经损伤的特效药物，因其发病部位主要位于脑部，一般临床医师采用作用于神经系统或脑血管的药物。安定具有镇静、抗惊厥等作用，可作为预防应激和治疗抑郁症患者的主要治疗药物之一，但其对高皮质激素血症引发的绝望样行为是否有影响以往鲜有报道。本研究观察了安定对高皮质激素血症小鼠绝望样行为的影响，并探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物雄性C57BL/6N小鼠50只，体质量20～24 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。饲养于南京中医药大学动物实验中心动物房，温度(23±1)℃，相对湿度40%～70%，明暗交替时间为12 h(6∶00～18∶00开灯)，自由饮食、饮水。

1.2药品及试剂安定购自江苏济川制药有限公司，皮质酮购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，盐酸氟西汀购自苏州制药有限公司。β-actin和突触素(SYP)单克隆抗体购自Santa Cruz公司(SC81178和SC17750)，小鼠神经微丝轻链(NF-L)单克隆抗体购自Invitrogen公司，HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自Gene Script公司；其他试剂均为分析纯，购自南京化学试剂公司。

1.3高皮质激素血症模型制备及安定的用法将50只C57BL/6N小鼠随机分为A、B、C、D、E组各10只，A、B、C、D组均制备高皮质激素血症模型，E组不作任何处理。制模后，D、E组以蒸馏水灌胃，A、B、C组分别以0.1 mg/kg安定、0.2 mg/kg安定、3.6 mg/kg盐酸氟西汀灌胃，1次/d，连续4周。

1.4小鼠绝望样行为评价

1.4.1强迫游泳实验强迫游泳实验参考文献[2]。在2 000 mL的玻璃烧杯中，加入25 ℃左右10 cm深的水，然后分别放入各组实验小鼠。保持C57BL/6N小鼠在烧杯中游泳6 min，记录小鼠在实验中后4 min的不动时间。

1.4.2强迫悬尾实验强迫悬尾实验参考文献[3]。强迫游泳结束24 h后，将小鼠悬挂于支架上，支架距桌面58 cm，胶带粘贴位置为小鼠尾尖1 cm处。每只小鼠悬挂5 min，记录实验中小鼠不动时间(小鼠被动顺从或完全不动)。

1.5海马组织NF-L、SYP检测方法采用Western blotting法。双侧海马组织用1 mL的RIPA 缓冲液匀浆并取上清液。Qubit2.0测定蛋白含量。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉PBST(含0.05%Tween-20的PBS液)37 ℃振荡1 h封闭。封闭结束后，一抗4 ℃静置孵育过夜，PBST漂洗3次，5 min/次。二抗室温孵育1 h，PBST漂洗3次，5 min/次，ECL发光试剂盒检测信号，化学发光成像仪成像，以Image Lab5.0数据分析。

2　结果

2.1各组小鼠悬尾不动时间、游泳不动时间比较小鼠悬尾不动时间、游泳不动时间比较见表1。

表1　各组小鼠悬尾不动时间、游泳不动时间比较(s, ±s)

注：与E组比较，#P<0.01；与D组比较，△P<0.01，*P<0.05。

2.2各组小鼠海马组织NF-L、SYP相对表达量比较小鼠海马组织NF-L、SYP相对表达量比较见表2。

表2　各组小鼠海马组织NF-L、SYP相对表达量比较

注：与E组比较，#P<0.01；与D组比较，△P<0.01，*P<0.05。

3　讨论

皮质激素受体在人体分布广泛，多种组织存在皮质激素受体，其中中枢神经系统中的皮质激素受体主要分布在海马组织及边缘系统，而该脑区与机体学习记忆、情绪紧密相关[4]。长期存在高皮质激素血症或行为应激的效应，能够对该脑区的正常功能甚至组织结构产生损伤作用，可导致海马锥状细胞萎缩及树突回缩、数量减少[5]，减少海马神经再生功能[6]和突触形成等，进一步可致神经元细胞核的碎裂和溶解，最终使海马组织萎缩功能障碍[7]。高皮质激素血症在动物实验中表现为体质量改变的同时还具有免疫抑制作用，长期高水平的血浆皮质激素可致免疫器官的减小和萎缩。

NF-L作为含量最为丰富的一种神经元骨架蛋白，是神经元细胞存活并发挥正常功能的物质基础，其亚型与应激导致的神经元损伤关系最为密切[8]。SYP作为神经元突触前膜的囊泡蛋白，其作用与突触结构和功能可塑性调节密切相关，可反映突触功能状态[9]。NF-L、SYP的变化能够对神经元组织结构和功能状态作出判断。

安定具有镇静、抗惊厥等作用，成人失眠、患病需镇静时常用此药[10]。安定可以降低肾上腺皮质的激活程度下降，使应激状态水平降低，从而使血浆中的皮质激素浓度降低，改善机体微循环和血流灌注，保护机体免受损伤；另有报道认为，服用安定后能够调节神经系统内单胺类神经递质，即上调脑内5-羟色胺；同时安定还能够抑制中枢神经系统中兴奋性氨基酸的毒性作用，抑制自由基合成保护神经元不受损伤[8]。本研究显示，与E组比较，D组悬尾不动时间短，游泳不动时间长；与D组比较，A、B、C组悬尾不动时间长，游泳不动时间短。与E组比较，D组NF-L、SYP相对表达量降低；与D组比较，A、B、C组的NF-L、SYP相对表达量升高。提示安定可改善高皮质激素血症小鼠绝望样行为，其机制可能与上调NF-L、SYP表达有关。

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国家中医药管理局重点学科温病学建设项目(1022091002002)。

马健(E-mail: majian67@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.010

R971

A

1002-266X(2016)15-0034-02

2015-12-03)