氮源对葡萄酒中挥发性化合物含量的影响研究

赵新节，姜凯凯，，孙玉霞，张　将，，王霄倩，3

（1.齐鲁工业大学生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353； 2.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100； 3.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

氮源对葡萄酒中挥发性化合物含量的影响研究

赵新节1，姜凯凯1，2，孙玉霞2，张将1，2，王霄倩2，3

（1.齐鲁工业大学生物工程学院，山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353； 2.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100； 3.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018）

选取云南省德钦县阿东、红坡、东水和布村4个村庄葡萄园的赤霞珠葡萄，测定葡萄汁中氨基酸和酵母可同化氮含量，并对所酿葡萄酒中挥发性化合物含量进行测定，分析葡萄汁中酵母可同化氮含量与葡萄酒中挥发性化合物含量之间的关系。结果表明，葡萄酒中异丁醇与葡萄汁中缬氨酸含量相关，葡萄酒中乙酸己酯和乙酸乙酯与葡萄酒中丝氨酸含量相关，葡萄酒中总酯与葡萄汁中总氨基酸含量相关；葡萄酒中正己醇和苯甲醇、乙酸苯乙酯、己酸和辛酸与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关，而异丁醇和丁二酸二乙酯与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈负相关。

氨基酸； 酵母可同化氮； 挥发性化合物； 葡萄酒

酵母在葡萄酒发酵期间主要的营养物质来源于葡萄，在大多数情况下，葡萄汁能够提供足够的糖、可利用氮、无机化合物和生长因子以满足发酵需要，如果葡萄汁重要营养物质缺乏，可以通过添加蔗糖或浓缩葡萄汁（加糖），或添加含无机铵和维生素的补充剂（维生素B1）。为了完成酒精发酵，酿酒酵母需要酵母可同化氮的浓度为140 mg/L［1］，同时氮需求的增长随着葡萄汁中的糖类浓度的增加而增加［2］。

葡萄汁是含有氨基酸和其他含氮化合物的复杂混合物，葡萄中含氮化合物浓度和分布受葡萄品种、砧木、营养条件、季节性条件和成熟程度的影响［3］。在自然环境中的酵母有使用大量含氮化合物作为唯一氮源的能力，但不是所有的含氮化合物都适合酵母生长和发酵活性的优化。事实上，酿酒酵母细胞能够选择性地优先使用良好的氮源，这种选择性是基于代谢物的阻遏机制，即当优良氮源存在时，劣质氮源代谢所需基因的转录受到了抑制［4］。在葡萄汁中主要的含氮化合物是游离氨基酸和铵离子，这构成了葡萄汁中2%～53%的酵母可同化氮［3］。酵母可同化氮为铵态氮和氨基酸的总和减去脯氨酸的含量，低浓度的可同化氮与低生物量［5］是导致缓慢的、不完全的发酵主要因素之一［6-7］，并且伴随着硫化物（如H2S）的频繁生产［8］。大量的研究表明，葡萄汁中的可同化氮浓度以及氮源的补充时间，有利于调节发酵酒中香气物质的形成［9-13］。

本实验采用云南省德钦县4个村庄葡萄园的赤霞珠葡萄为原料，通过对葡萄汁中氨基酸、酵母可同化氮含量，以及所酿葡萄酒中挥发性香气物质的测定，探寻葡萄汁中氮源物质与葡萄酒香气物质含量的相关性。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

原料：赤霞珠葡萄，2014年9月30日分别采自云南德钦县阿东、红坡、东水、布村，株行距1.0×2.0 m，单干双臂，常规管理。

试剂：偏重亚硫酸钾（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醛溶液（分析纯），莱阳市康德化工有限公司；氢氧化钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；氯化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；4-甲基-2-戊醇（色谱纯，98%），美国Aldrich公司。

仪器：日立L-8900全自动氨基酸分析仪，日立高新技术公司；SPME手动进样手柄、DVB/CAR/PDMS复合萃取头（50/30 μm），美国Supelco公司；GC-7890B/MS-5977A气相色谱-质谱联用仪、VF-WAXms（30 m× 0.32 mm×0.25μm）色谱柱，美国Agilent公司。

1.2葡萄酒酿造

葡萄样品各5 kg除梗和破碎后放入容积为5 L的带盖广口瓶中，添加偏重亚硫酸钾使总SO2浓度达到50 mg/L，浸渍24 h后按照0.2 g/L添加D254酵母于葡萄醪中，室温发酵。

发酵期间，每天通过比重计测定葡萄酒比重，直到比重＜0.996、残糖＜4 g/L，皮渣分离。酒样放置于玻璃瓶中，密封贮存于-40℃待测。

1.3分析方法

1.3.1酵母可同化氮含量测定

采用甲醛滴定法测定葡萄汁中酵母可同化氮的含量。取5 mL葡萄汁，加入45 mL去离子水，加入5 mL甲醛，用氢氧化钠溶液滴定至pH9.0，重复3次。

可同化氮（mgN/L）=（V1×C×14×D×1000）/V2

式中：V1——氢氧化钠体积，L；

C——氢氧化钠浓度，mg/L；

D——稀释倍数；

V2——样品体积，L。

1.3.2游离氨基酸含量测定

使用日立L-8900全自动氨基酸分析仪测定葡萄汁中氨基酸含量。采用4.6 mm ID×60 mm色谱柱，日立专用离子交换树脂，柱温箱设定57℃，使用可见光检测器：波长为570 nm和440 nm，进样量20 μL，流速0.40 mL/min，梯度洗脱，洗脱时间35 min。

1.3.3挥发性化合物测定

酒样通过顶空固相微萃取-气质联用技术测定可挥发性化合物［9，14］。色谱分析在配备有5977A MSD的Agilent 7890B气相色谱仪上进行。挥发性化合物用VFWAXms（30 m×0.32 mm）的毛细管气相色谱柱（Agilent，Santa Clara，CA，USA）分离。具体操作如下，在15 mL顶空瓶中加入8 mL发酵结束葡萄酒，1.5 g NaCl和20 mL 的2.00 g/L内标物4-甲基-2-戊醇，以及转子。放置于45℃的可加热磁力搅拌器上，预热10 min后进行萃取，萃取50 min后进样。解析10 min，解析结束后，柱子在40℃下保持2 min，然后以6℃/min升到230℃，保持15 min。载气为氦气，平均线速度为25 cm/s。不分流进样。所有质谱在70 eV下冲击，扫描范围为30～400原子质量单位，在每秒3.9次扫描速度下获得。采用内标法确定挥发性化合物的含量。

1.4数据处理

采用SPSS 19.0进行数据分析，多组间比较采用One-WayANOVA法，两组间相关性采用Person’s法。

2　结果与分析

2.1不同葡萄园葡萄汁酵母可同化氮、氨基酸含量

本实验选取了云南省德钦县葡萄酒产区的4块不同的葡萄园，分别是阿东、红坡、东水和布村，各葡萄园葡萄汁中酵母可同化氮含量分析结果见表1。

表1　不同实验葡萄园的葡萄汁可同化氮（mg/L）和氨基酸（%）

由表1可知，4个葡萄园的葡萄中酵母可同化氮含量存在显著性差异（p＜0.05），含量最高的为阿东，其次是布村，最少的是红坡；且氨基酸含量在4个葡萄园中也存在差异，葡萄中氮源含量主要与葡萄园氮肥施用量、葡萄园的管理以及葡萄园的气候条件相关。

2.2不同葡萄园葡萄酒挥发性化合物差异性分析

通过顶空固相微萃取-气质联用技术测定葡萄酒中与酵母氮源代谢相关的挥发性化合物，4个葡萄园的葡萄酒中共检测出46种醇类、酸类、酯类挥发性化合物，其中阿东、红坡、东水和布村分别检测出37种、38种、35种、43种挥发性化合物，布村检测到的挥发性化合物种类最多，且与其余3个酒样相差较大，东水检测到的挥发性化合物种类最少，各挥发性化合物含量见表2。

表2　不同实验葡萄园的葡萄酒挥发性化合物含量　（μg/L）

由表2可知，4个葡萄园的葡萄所酿葡萄酒挥发性化合物含量相差较大，其中阿东挥发性化合物总量为6680.23 μg/L，在4个葡萄酒样中含量最高，其次是东水、布村和红坡，分别为5547.17 μg/L、5214.91 μg/L和4732.36μg/L。苯甲酸乙酯仅在阿东葡萄酒中检测到；正丁醇仅在东水和布村葡萄酒中检测到；癸醇、1-辛烯-3-醇（蘑菇醇）、正戊醇、香茅醇和2-乙烯酸仅在红坡和布村葡萄酒中检测到；辛酸-3-甲基丁酯仅在红坡和东水葡萄酒中检测到；壬酸、丁内酯、辛酸甲酯和乳酸乙酯仅在阿东和布村葡萄酒中检测到；水杨酸乙酯仅在布村葡萄酒中未检测到；3-甲硫基-1-丙醇和3-乙氧基-1-丙醇仅在红坡葡萄酒中未检测到；4-甲基-1-戊醇，正辛醇和2-甲基-1-己醇仅在阿东葡萄酒中未检测到。

表3　不同实验葡萄园的葡萄酒挥发性化合物含量与可同化氮相关性

2.3可同化氮与葡萄酒挥发性化合物含量的相关性

2.3.1醇类

由表2可知，共检测出19种醇类。在葡萄酒中，高级醇指拥有超过2个碳原子的醇［15］，当浓度低于300 mg/L时，高级醇有助于增加葡萄酒的复杂度［16］。当它们的浓度超过400 mg/L时，高级醇作为葡萄酒的一个消极的品质因数。

由表3可以看出，正己醇和苯甲醇与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关，阿东酵母可同化氮含量为479.93 mg/L，是4个葡萄园中最高的；布村次之，为425.08 mg/L；再就是东水395.37 mg/L；最低的是红坡，为346.24 mg/L，本实验中，正己醇和苯甲醇含量同样也表现这样的趋势，而异丁醇与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈负相关。Teresa Garde-Cerda´n等［11］添加不同浓度氨基酸于葡萄汁中，最后测其香气物质含量，结果同样表明正己醇和苯甲醇与添加到葡萄汁中氨基酸含量呈正相关，与异丁醇含量呈负相关。正己醇、苯甲醇和异丁醇的形成与葡萄汁中可同化氮的含量有直接关系，它们的形成可能主要是由埃利希途径产生。本实验中检测到的其他醇类的含量与添加到葡萄汁中的可同化氮含量没有显著的相关性（表2）。

2.3.2酸类

脂肪酸使葡萄酒有着新鲜，或者是不愉快的味道，如果它们过量，也有助于掩盖其他味觉感受［17］。从表2可看出，共检测出10种酸类。由表3可看出，己酸和辛酸与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关。酵母合成的脂肪酸与碳水化合物的代谢有关，因为葡萄糖是它的前体乙酰辅酶A的主要来源［18］，葡萄汁中氨基酸的添加很有可能对酸的形成有间接影响。

2.3.3酯类

葡萄酒中的主要酯类在酵母内部合成酶催化下，由醇和酸合成，乙酰CoA通过乙酰辅酶A与高级醇缩合形成乙酸酯类［19］，乙基酯通过酶催化乙醇和活跃的中长链脂肪酸而形成［18］。乙酸乙酯通常是葡萄酒中含量最丰富的酯。当葡萄酒中乙酸乙酯的浓度高于150 mg/L，能给葡萄酒带入不愉快的气味（酸味）［20］。

在本研究中，共检测出24种酯类，乙酸乙酯的浓度与添加到葡萄汁中的酵母可同化氮的浓度无显著相关性（表2）。由表3可以看出，乙酸苯乙酯与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关，丁二酸二乙酯与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈负相关。Teresa等［11］研究发现，丁二酸二乙酯和3-羟基丁酸乙酯的形成与添加到葡萄汁中的氨基酸数量成反比例关系。

2.4游离氨基酸与葡萄酒中挥发性化合物的相关性

研究表明，缬氨酸与异丁醇的合成相关［21］。本实验测定红坡缬氨酸含量最高（表3），且异丁醇含量（表2）也是这4个葡萄酒中含量最高的，正好印证以前的研究。Fukuda等［22］研究表明，丝氨酸参与了乙酸酯水解酶的催化活性。本实验研究发现，东水葡萄汁中的丝氨酸含量最高（表3），而东水葡萄酒中乙酸己酯和乙酸乙酯含量（表2）最低。在酒精发酵期间，酿酒酵母能够将氨基酸通过埃里希途径来生产各种挥发性芳香化合物［23］。本实验表明，布村葡萄汁中总氨基酸含量最高（表3），且葡萄酒中总酯含量也为最高（表2）。

3　结论

本实验表明，葡萄酒中异丁醇与葡萄汁中缬氨酸相关，葡萄酒中乙酸己酯和乙酸乙酯与葡萄酒中丝氨酸相关，葡萄酒中总酯与葡萄汁中总氨基酸相关；正己醇和苯甲醇与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关，而异丁醇与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈负相关，己酸和辛酸与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关，乙酸苯乙酯与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈正相关，而丁二酸二乙酯与葡萄汁中的酵母可同化氮含量呈负相关。可以说，在浓度研究中，葡萄汁中酵母可同化氮在一定范围内有利于在葡萄酒中的挥发性化合物的形成。本研究对生产和进一步的研究酵母可同化氮提供参考价值。

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Effects of Nitrogen Sources on Volatile Compounds Content in Grape Wine

ZHAO Xinjie1，JIANG Kaikai1，2，SUN Yuxia2，ZHANG Jiang1，2and WANG Xiaoqian2，3
（1.Shandong Key Lab of Microbial Engineering，College of Biological Engineering，Qilu University of Technology，Ji’nan，Shandong 250353；2.Institute ofAgro-Food Science and Technology，ShandongAcademy ofAgricultural Sciences，Ji’nan，Shandong 250100；3.College of Food Science and Engineering，ShandongAgricultural University，Taian，Shandong 271018，China）

The content of amino acid and yeast assimilable nitrogen in grape juice（Cabernet Sauvignon grape from four different village vineyards（Adong，Hongpo，Dongshui，Bucun）in Deqin，Yunnan）was measured.In addition，the content of volatile compounds in grape wine produced by these grape juice was determined.And the relations between the content of yeast assimilable nitrogen in grape juice and the content of volatile compounds in wine were analyzed.The results suggested that，isobutyl alcohol in wine was associated with valine content in grape juice，hexyl acetate and ethyl acetate in wine were associated with toserine content in grape juice，total esters content in wine was associated with total amino acids content in grape juice；hexanol，benzyl alcohol，phenethyl acetate，hexanoic acid and octanoic acid in wine were positively correlated to the content of yeast assimilable nitrogen，and isobutanol and diethyl ester butanedioic were negatively correlated to the content of yeast assimilable nitrogen in grape juice.

animo acids；yeast assimilable nitrogen；volatile compounds；wine

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）08-0044-05

10.13746/j.njkj.2016100

山东省重点研发计划项目（2015GNC113010）；山东省现代农业产业技术体系专项基金（SDAIT-03-021-12）；泰山学者工程专项经费；云南省建立农科教相结合新型农业社会化服务体系试点项目（2014NG005）；山东省农业重大应用技术创新课题（2013）。

2016-03-22

赵新节（1962-），男，教授，博士；姜凯凯（1989-），男，在读研究生。

孙玉霞（1973-），女，副研究员，硕士。

优先数字出版时间：2016-06-03；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160603.1613.006.html。