超声成像技术在大西洋鲑早期性别及发育期鉴别的应用研究

仇登高, 徐世宏, 刘 鹰, 6, 宋昌斌, 迟 良, 王顺奎, 于凯松



超声成像技术在大西洋鲑早期性别及发育期鉴别的应用研究

仇登高1, 2, 5, 徐世宏1, 5, 刘 鹰1, 5, 6, 宋昌斌3, 迟 良1, 王顺奎4, 于凯松4

(1. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 2. 福建省水产研究所 福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室, 福建 厦门 361013; 3. 中国科学院 半导体研究所, 北京 100083; 4. 山东东方海洋科技股份有限公司, 山东 烟台 264003; 5. 海洋生态养殖技术国家地方联合工程实验室, 山东 青岛 266071; 6. 大连海洋大学, 辽宁 大连 116023)

采用KX-5100便携式B超机(7.5MHz高频线阵探头)对273尾1龄或2龄大西洋鲑()的性别及性腺发育阶段进行了检测, 同时对检测的大西洋鲑进行了解剖和取样, 利用组织学观察法验证了超声成像技术对大西洋鲑雌雄性别和发育阶段的鉴别结果。研究结果显示: 利用超声成像技术鉴别雌、雄大西洋鲑的平均准确率为86%, 且鉴别雌鱼的准确率(93%)较雄鱼(81%)高。超声成像技术鉴别Ⅱ期+Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期卵巢的准确率分别为87%、92%和100%, 鉴别Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期精巢的准确率分别为64%、71%、86%和84%。总体看来, 超声成像技术鉴别早期性腺(Ⅱ期~Ⅲ期)发育的准确率较低, 仅为75%, 而对晚期性腺(Ⅳ期~Ⅴ期)发育鉴别的准确率较高, 达到89%。

超声成像技术; 大西洋鲑(); 早期性别鉴别; 性腺发育阶段

大西洋鲑()属鲑形目(Salmonifomes)、鲑科(Salmonidae)、鲑属(), 为世界范围养殖的冷水性鱼类。大西洋鲑在性成熟阶段, 雌鱼体色会变成棕色或黄色, 雄鱼鳞片上的黑色斑点变为红色, 上下颌延长并弯曲成钩状[1]。但是, 在性腺开始发育初期, 雌、雄个体的第二性征不明显, 从外部形态难以鉴别其性别和性腺发育期, 而在同池饲养的过程中, 雌、雄大西洋鲑可以各自分泌性激素诱导对方性腺成熟[2], 造成大西洋鲑的生长趋缓、鱼肉品质下降等问题。因此, 如何快速准确地鉴别大西洋鲑早期性别对促进科学管理和精准养殖十分有必要。目前, 国内外传统的性别鉴别技术主要有腹腔外科手术法[3]、内窥镜法[4]、卵黄蛋白浓度分析法[5]、放射免疫测定法[6]等。这些检测技术尽管可以获得比较高的鉴别准确率, 但是耗时较长且工作量较大, 并且还要侵入鱼类体内, 容易造成细菌等微生物的感染, 甚至可能导致检测鱼的死亡[7]。相比之下, 超声成像技术是一项无损伤、速度较快、准确率高的检测技术, 当前已广泛应用于医疗和兽医行业。国外一些学者将超声成像技术引入到鱼类养殖领域, 如Shields[8]等采用超声波诊断技术检测了庸鲽()卵母细胞成熟程度和排卵期; Blythe[9]等超声检查了条纹狼鲈()雌雄性别和成熟状况;

Wildhaber[10]等报道了超声鉴别亚拉巴马铲鲟()性别技术; Mattson[11]初步建立了超声波扫描技术鉴别大西洋鲑性别和性腺大小的方法, 同时作者指出超声图像质量和测量可靠性需要进一步改进和提高。目前, 随着科学技术的飞跃发展, 超声成像技术已升级换代, 有必要采用现代的、图像更为清晰细腻的便携式超声诊断仪进一步优化大西洋鲑早期性别及性腺发育阶段的无损鉴别技术。基于上述考虑, 作者通过超声成像技术检测大西洋鲑的性别和性腺发育阶段, 掌握不同发育阶段卵巢和精巢的超声波图像特征, 以期为超声波检测技术在中国鱼类养殖中的应用研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验所用大西洋鲑于2012年4月~12月取自山东东方海洋科技股份有限公司开发区分公司鱼类研究中心, 随机取1~2龄大西洋鲑273尾, 体质量为200~2 880 g, 体长为25.2~54.5 cm。

1.2 方法

1.2.1 仪器

采用徐州市凯信电子设备有限公司生产的全数字B超诊断仪KX5100。探头选择线阵宽频探头, 频率为7.5 MHz, 扫描深度选择为6~24 cm。

1.2.2 实验鱼饲养环境

降海后的大西洋鲑饲养在水温相对恒定的循环水养殖生产系统的八边形水泥池内, 养殖池规格为长7 m、宽7 m、深2.3~2.5 m, 养殖期间盐度为28±2.7, 水温为13.6~15.0℃。

1.2.3 操作方法

取样前将实验鱼用MS-222(20 ppm ~40 ppm)麻醉, 待大西洋鲑安静不挣扎时, 采用KX-5100超声波诊断仪(线阵高频探头, 7.5 MHz)进行性腺的超声波扫描并拍照。检测时, 被检测鱼侧放于光滑的桌面, 鱼的腹部朝向操作者, 操作者手持探头, 将探头对准脊椎方向, 并紧贴鱼体鳃盖后缘呈45°进行测量, 轻轻摆动探头以获得较清晰的图像(图1)。

1.3 数据统计

采用SPSS18.0统计软件和Excel对测定结果进行分析, 实验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。

2 结果

2.1 大西洋鲑不同性腺发育阶段的超声图像特征及检测结果

实验开始时, 雌性大西洋鲑(200~300g)超声成像技术获得的卵巢超声图像呈小三角形(图2-1)。对应的组织学观察显示, 在数量和面积上, 卵巢内部主要以第2时相初级卵母细胞为主(图2-2)。卵巢进入Ⅲ期时, 超声成像技术所得到的图像呈类似三角形的形状, 结构较紧密(图2-3)。对应组织学观察显示, 此期卵巢内生殖细胞以第3时相进入大生长期的初级卵母细胞为主, 细胞体积明显变大。图2-4显示Ⅲ期中初级卵母细胞, 细胞近似椭圆形, 伴随细胞的发育核仁增大, 细胞质内含有卵黄颗粒, 分布在细胞质的部分区域, 此期细胞核还未出现极化现象。卵巢发育至第4时相早期时, 该期超声波图像类似于Ⅲ期, 呈三角形。当卵巢发育进入第4时相中、后期及第5时相时, 此阶段超声波图像显示卵巢位于肾脏的一侧, 在图像上可清楚地看到白色圆形亮点结构, 该亮点为卵细胞(图2-5)。对应组织学观察显示, Ⅳ期卵巢内生殖细胞主要以第4时相初级卵母细胞为主, 按照卵母细胞的核偏移情况将此期卵母细胞分成早、中、晚3个阶段。图2-6显示卵细胞发育至第4时相后期阶段, 细胞核极化, 且抵达动物极。图2-7、2-8分别为Ⅴ期卵巢超声图像和相应的组织学观察。因此, 可通过性腺在超声波图像上所呈的三角形或白色圆形颗粒结构作为雌性大西洋鲑未成熟与成熟的判别标准, 也可作为雌雄鉴别的标准。

雄性大西洋鲑(约200g)精巢为Ⅱ期, 这个时期精巢在超声波图像上看不出明显的特征(图3-1)。对应组织学观察显示, Ⅱ期精巢的精小叶内含有初级精原细胞和次级精原细胞, 初级精原细胞单个位于精小叶边缘, 核膜比较清晰, 中心位置有一核仁, 次级精原细胞由初级精原细胞分裂而来, 往往位于精小叶内部的精小囊中(图3-2)。图3-3显示Ⅲ期精巢的超声波图像也无明显的特征, 图3-4为此时图像所对应的组织学观察。当精巢发育至Ⅳ期时, 此期的超声波图像显示精巢在肾脏的上部, 呈现不规则黑影(图3-5)。对应的组织学观察显示, 发育至Ⅳ期的精巢开始出现少量的精子, 但是精小叶内部精子细胞占很大部分, 另还含有少量的初级精母细胞及次级精母细胞。此阶段的精子细胞排列比较紧密, 发育基本上处于同步状态, 精子细胞的着色比初级精母细胞和次级精母细胞要深, 嗜碱性能力较强(图3-6)。图3-7、3-8分别为Ⅴ期精巢超声图像和相应的组织学观察。因此, 可通过观察精巢在B超诊断仪上所呈现出不规则黑影的超声波图像作为雄性大西洋鲑成熟的判别标准。

2-1. Ⅱ期卵巢超声波图像; 2-2. Ⅱ期卵巢; 2-3. Ⅲ期卵巢超声波图像; 2-4. Ⅲ期卵巢; 2-5. Ⅳ期卵巢超声图像; 2-6. Ⅳ期卵巢; 2-7. Ⅴ期卵巢超声图像; 2-8. Ⅴ期卵巢; Ovary. 卵巢; Ovum. 卵子; OC. 卵母细胞; N. 细胞核

2-1. Ultrasound image of ovary at phase II; 2-2. ovary at phase II; 2-3. ultrasound image of ovary at phase III; 2-4. ovary at phase III; 2-5. ultrasound image of ovary at phase IV; 2-6. ovary at phase IV; 2-7. ultrasound image of ovary at phaseV; 2-8. ovary at phaseV; OC. oocyte; N. nucleus

从上述超声波图像可得到, 不同发育阶段的卵巢和精巢的超声波图像有比较明显的差异: Ⅱ期和Ⅲ期卵巢的超声波图像呈小三角形, 结构紧密; Ⅳ期和Ⅴ期卵巢的超声波图像呈白色亮点的圆形颗粒结构。而Ⅳ期和Ⅴ期精巢的超声波图像则呈不规则黑影, 但Ⅱ期和Ⅲ期精巢的超声波图像无明显的判别特征, 这两个时期的精巢需要排除Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅴ期卵巢及Ⅳ期和Ⅴ期精巢来确定。

2.2 大西洋鲑性别及性腺发育期的鉴别结果

利用超声成像技术鉴别雌鱼的准确率较雄鱼高, 超声成像技术正确鉴别出经组织学观察法验证的107 尾雌鱼中的99 尾, 准确率为93%; 在鉴别的166 尾雄鱼中, 经验证有135尾雄鱼, 准确率为81%; 超声成像技术共计鉴别273尾鱼, 正确鉴别出234尾, 雌雄平均准确率达到86%(表1)。

超声成像技术鉴别雌鱼卵巢发育的准确率随卵巢的发育而提高, 而雄鱼精巢发育的准确率随精巢的发育呈现先上升后下降的趋势, 如表2所示: 此技术鉴别Ⅱ期+Ⅲ期、Ⅳ期卵巢的准确率分别为87%、92%, 对Ⅴ期卵巢鉴别的准确率达到100%。超声成像技术鉴别Ⅱ期精巢的准确率仅为64%, 对Ⅲ期、Ⅳ期精巢鉴别的准确率分别为71%、86%, 精巢发育至Ⅴ期时的准确率为84%。超声成像技术鉴别雌雄性腺发育阶段的平均准确率为82%。超声成像技术鉴别早期性腺(Ⅱ~Ⅲ期)发育的准确率较低, 仅为75%; 对后期性腺(Ⅳ~Ⅴ期)发育鉴别的准确率较高, 达到89%。

3-1. Ⅱ期精巢超声波图像; 3-2. Ⅱ期精巢; 3-3. Ⅲ期精巢超声波图像; 3-4. Ⅲ期精巢; 3-5. Ⅳ期精巢超声波图像; 3-6. Ⅳ期精巢; 3-7. Ⅴ期精巢超声波图像; 3-8. Ⅴ期精巢; Spermary. 精巢; SG. 精原细胞; SL. 精小叶; PSC. 初级精母细胞; SSC. 次级精母细胞; S. 精子

3-1. ultrasound image of spermary at phase II; 3-2. spermary at phase II; 3-3. ultrasound image of spermary at phase III; 3-4. spermary at phase III; 3-5. ultrasound image of spermary at phase IV; 3-6. spermary at phase IV; 3-7. ultrasound image of spermary at phase V; 3-8. spermary at phase V; SG. spermatogonia; SL. seminal lobule; PSC. primary spermatocytes; SSC. secondary spermatocytes; S. spermatozoa