紫菜纳豆菌发酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

黄莺莺, 董焕焕, 杨苗苗, 矫丽萍, 邵 霜, 岳 琪, 魏玉西



紫菜纳豆菌发酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

黄莺莺, 董焕焕, 杨苗苗, 矫丽萍, 邵 霜, 岳 琪, 魏玉西

(青岛大学 生命科学学院, 山东 青岛 266071)

纳豆菌()发酵后的条斑紫菜经稀释、离心后上清液用一定浓度的乙醇处理获得醇沉物和醇溶液。将醇沉物去蛋白得到粗多糖, 进行抗氧化活性的研究; 将醇溶液旋转蒸发得到浸膏, 将浸膏按极性大小分相萃取分别得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏, 探讨分相浸膏对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、四联微球菌的抑菌效果。通过测定多糖和分相浸膏对羟自由基(·OH)和DPPH自由基的清除能力评价其抗氧化能力。结果表明: 醇溶物对金黄色葡萄球菌具有抑制作用, 且随着浓度的升高各相浸膏对羟基自由基的清除率随之升高, 其中, 正丁醇相浸膏在质量浓度为0.5 mg/mL时对羟自由基的清除率达到91.6%, 说明条斑紫菜经纳豆菌发酵可能产生了活性化合物; 与对照组相比, 利用纳豆菌发酵紫菜发酵物中多糖提取率增加了0.24%, 发酵得到的多糖在质量浓度为5.0 mg/mL时对羟自由基的清除率达到了95.7%。

条斑紫菜(); 纳豆菌(); 多糖; 醇提物; 抗氧化性; 抑菌活性

纳豆菌, 别名纳豆芽孢杆菌(), 是一种革兰氏阳性菌。既具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力, 又能产生多种抗菌素和酶, 而且纳豆菌分泌酶的能力比其他枯草芽孢杆菌高几十倍[1-2]。纳豆激酶是在纳豆发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶, 具有溶解血栓、降低血黏度、改善血液循环、软化和增加血管弹性等作用[3-4]。纳豆菌发酵技术于2000多年前起源于我国, 目前在日本纳豆作为一种传统发酵食品, 一直是日本国民膳食结构的主要组成部分[5]。纳豆菌发酵原料除大豆外, 还被用来与乳酸菌共同发酵制备酸奶, 以果渣为底物发酵剩余豆渣等[6], 发酵高档水产品加工废弃物和低值水产品, 并带来较好的经济效益[7-8]。

紫菜属海洋红藻, 其中含丰富的蛋白质、碳水化合物、各种维生素和矿物质。同时紫菜还可以入药, 具有化痰软坚、清热利水、补肾养心之功效[9]。紫菜在我国各地人工养殖产量大, 资源相当丰富, 其应用前景广阔。

国内已有学者研究以纳豆菌发酵紫菜, 再添加木瓜蛋白酶酶解的方法从中提取紫菜蛋白多肽以及研究该法对蛋白提取率的影响[10]。但是, 关于纳豆菌发酵物中多糖和醇溶物的生物活性均未见报道。本文利用纳豆菌对条斑紫菜进行发酵, 以未发酵的条斑紫菜作对照, 研究条斑紫菜纳豆菌发酵物中多糖和醇溶物的抗氧化和抑菌活性, 预期研究结果对充分利用紫菜资源提供重要基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

条斑紫菜(干), 2014年12月购自江苏连云港和润紫菜加工有限公司。

1.1.2 菌株

纳豆芽孢杆菌()菌粉购自中山市纳豆微生物制品有限公司; 枯草芽孢杆菌()、金黄色葡萄球菌()、四联微球菌), 由青岛大学生命科学学院微生物学实验室提供。

1.2 主要仪器与设备

DXF-10A型多功能摇摆式粉碎机(广州市大祥电子机械设备有限公司); YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂); CR21G高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器有限公司); RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂); SW-OJ-IFD洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司); 721G可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司); 冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 醇提物和多糖的制备

参考文献[11]并作适当改进。选取条斑紫菜(干)于40℃恒温干燥箱中干燥12 h, 研磨成粉末后称取两份等量的紫菜粉末, 一份为实验组, 另一份为对照组, 均按照料液比为1︰16加入蒸馏水, 搅拌均匀后放入高压湿热灭菌锅中灭菌20 min。实验组发酵条件为: 温度43℃, 发酵时间24 h, 接种量为每3 g条斑紫菜样品加0.01 g纳豆菌。对照组除不加纳豆菌外, 其余条件均与实验组相同。发酵结束, 两组同时按照料液比1︰40加蒸馏水, 常温水提5 h, 冷冻离心(8 000 r/min)10 min。上清液加入95%乙醇并调至终浓度为80%, 于4℃的冰箱中静置过夜后再次离心, 收集醇不溶物。上清液即为醇提物, 经旋转蒸发后依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取12 h, 相同溶剂萃取两次。合并萃取液经旋蒸得石油醚相浸膏(实验组A, 对照组A)、乙酸乙酯相浸膏(实验组B, 对照组B′)和正丁醇相浸膏(实验组C, 对照组C′)。第一次醇沉得到的醇不溶物冷冻干燥后研磨, 按照水料比30︰1 (/)加水于80℃恒温水浴锅中放置1 h, 取出后冷却至室温, 离心(8 000 r/min) 20 min, 沉淀即为杂蛋白(弃去), 上清液加95%乙醇至体积分数为80%, 在4℃冰箱中静置过夜, 离心(5 000 r/min) 10 min, 取沉淀物冷冻干燥即得粗多糖。

1.3.2 多糖含量的分析方法

总糖含量测定: 选用苯酚—硫酸法, 以葡萄糖为标准物, 在490 nm处测定多糖含量[12]。

紫菜多糖提取率(%)=紫菜多糖提取量/紫菜原料质量×100 %

1.3.3 蛋白质含量的分析方法

蛋白质的测定: 选用考马斯亮蓝比色法。

1.3.4 醇提物对三种菌的抑制作用

参考文献[13-15]并作适当改进。旋转蒸发后的各相浸膏均用二甲基亚砜作溶剂溶解, 分别取实验组和对照组的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏样品配制20 g/L的溶液, 对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、四联微球菌进行抑菌实验。用生理盐水分别配制菌悬液。待培养皿湿热灭菌冷却后加入营养琼脂培养基15 mL, 摇匀, 置水平位置待其凝固。将三种菌分别接入培养皿中, 用打孔器在培养基中等距离打7个孔, 向每个孔中加20 μL样品溶液, 分别为对照组和实验组不同相的6种溶液, 同时以二甲基亚砜作为空白对照。每种细菌设3个平行样, 于37℃恒温培养16~24 h后, 测量抑菌圈直径, 找出抑菌效果最好的细菌作为后续实验的指示菌。

分别取实验组和对照组的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏样品, 采用二倍稀释法配制浓度为20, 10和5 g/L溶液。采用稀释涂布平板法接种指示菌, 在每个培养皿上均匀地打7个孔, 每个孔中加样20 μL, 以二甲基亚砜作为空白对照。于37℃恒温培养16~24 h后, 测量、记录结果。每个浓度梯度做3次平行实验[16], 结果取平均值。

1.3.5 醇提物和多糖抗氧化活性的研究

1.3.5.1 对羟自由基的清除率

参考文献[17]方法进行。多糖和旋转蒸发后的各相浸膏均用去离子水溶解, 在Fenton体系下, 进行清除羟基自由基作用的研究。取标记好空白管、对照管以及不同浓度的样品管, 先分别向试管中加入0.15 mol/L, pH7.4的磷酸盐缓冲液0.5 mL, 6 mmol/L的EDTA二钠亚铁溶液0.5 mL, 520 μg/mL的番红溶液0.1 mL, 再分别向不同浓度的样品管中加入3.5 mL样品的去离子水溶液, 最后再加入0.3%(/)的H2O20.4 mL。空白管将样品溶液用等体积去离子水代替, 对照管将样品溶液和H2O2溶液用等体积去离子水代替。混匀后放置于40℃恒温水浴中保温30 min, 然后在520 nm处测其吸光度。每个样品重复操作3次, 取三次结果的平均值。实验中将Vc作为阳性对照进行试验。

清除率的计算公式: 清除率(%)=(样品–空白)/ (对照–空白)×100%

式中:样品为样品管吸光度;空白为空白管吸光度;对照为对照管吸光度。

1.3.5.2 对DPPH自由基的清除率

参照文献[18]方法进行。多糖和旋转蒸发后的各相浸膏均用去离子水溶解, 分别向试管中加入不同浓度的样品溶液2.0 mL, 然后分别加入0.2 mmol/L的DPPH溶液2.0 mL, 混匀后静置30 min, 测定反应液在517 nm处的吸光度i; 以无水乙醇作参比, 测定2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇混合后的吸光度0; 测定2.0 mL的样品溶液与2.0 mL无水乙醇混合后的吸光度j。实验以Vc作为对照。

清除率的计算公式: 清除率(%)=[1–(i–j)/0]×100%

式中:i-样品管吸光度;j-空白管吸光度;0-背景吸收。

1.3.5.3 对超氧阴离子的清除率

参照文献[19]方法进行。用去离子水将紫菜多糖溶解, 采用邻苯三酚自氧化法测其对超氧阴离子清除率。取4.5 mL Tris-HCl缓冲溶液(50 mmol/L, pH8.2)于25 mL试管中, 加入4.2 mL重蒸水混匀, 再放入37℃水浴中保温, 20 min后取出并立即加入在37℃预热过的0.5 mL 3 mmol/L邻苯三酚溶液(以10 mmol/L HCl配制), 空白管用0.5 mL 10 mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液, 迅速摇匀, 倒入比色皿, 于325 nm波长处每隔30 s测定吸光度(a)及空白管吸光度(b)。实验组先加入2 mL各质量浓度的紫菜多糖溶液, 再加入邻苯三酚溶液, 重蒸水相应减少, 再根据邻苯三酚自氧化测定的方法操作, 测各样品吸光度(i)。以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作为空白, 测定其本底吸光度(j), 每个样品重复3次取平均值。以Vc做阳性对照。

清除率的计算公式: 清除率(%)=[(a–b)–(i–j)]/(a–b)×100

2 结果与分析

2.1 两组提取物旋蒸后各相浸膏的质量

实验组和对照组均称取150 g紫菜粉末, 经浸提、醇沉、分相萃取、旋蒸后, 最终得到各相浸膏的质量如表1所示。实验组最终得到的各相浸膏质量均高于对照组, 推测紫菜经纳豆菌发酵后其乙醇可溶性物质组成及含量发生了变化。