鱼腥草组分对生物膜的抑制作用及其应用

李成，娄在祥，王洪新（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏无锡214122）

鱼腥草组分对生物膜的抑制作用及其应用

李成1，2，娄在祥1，2，王洪新1，2
（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏无锡214122）

研究了体积分数30%乙醇洗脱的鱼腥草柱层析组分对细菌生物膜的抑制活性，发现鱼腥草组分质量浓度在4.0 mg/mL的时候，对E.coli生物膜及Salmonella typhimurium生物膜形成的抑制率均为100%，同时鱼腥草组分在3.0 mg/mL和4.0 mg/mL时分别完全能够抑制E.coli和Salmonella typhimurium的生长。对鱼腥草组分进行成分分析，发现其主要成分为3，4-二羟基苯甲酸、绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮苷以及槲皮素。同时研究了鱼腥草柱层析组分对冷藏猪肉的保鲜效果，对微生物含量、挥发性盐基氮（TVB-N）、pH以及汁液流失率均有积极效果，在柱层析组分质量浓度为4.0 mg/mL的时候，每克肉品在15 d时微生物数量对数值达到5.95，而此时对照组微生物数量对数值为8.01。结果表明，鱼腥草柱层析组分在冷藏猪肉贮存中具有一定的应用潜力。

鱼腥草；生物膜；活性；冷藏肉；贮存

细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而在固体表面上生长的一种与游走态细胞相对应的存在形式。生物膜细菌与游离或浮游的细菌在形态和生理特征上均有着显著的区别。由于膜的包裹，化学品很难有效地渗入生物膜，因而很难将膜内的细菌钝化，其对抗生素的抵抗力要比自由存在的单个细菌高1 000倍以上［1-2］。冷藏猪肉是生鲜猪肉的一种新型消费形态，代表着生鲜猪肉生产和消费的发展方向。但是在贮存过程中因为污染微生物的生长繁殖，导致产品的腐败，这一直是困扰生产者的一个重要问题，同时也是消费者最为关注的肉品安全的核心问题。由于细菌生物膜是抑制细菌的关键，因此在生鲜猪肉贮存期间，保鲜过程中抑制其生物膜的形成有着至关重要的作用［3］。

鱼腥草（Houttuynia cordata）属三白草科蕺菜属野生草本植物，分布在长江以南及西藏等省区。鱼腥草中VC质量分数高达202.5 mg/kg，是小白菜VC含量的2.3倍；有机酸质量分数高达0.264%，与商品腌菜含量相当；氨基酸态氮质量分数为0.158%，是一种比较理想的野生蔬菜［4-5］。以往对鱼腥草的药用及药理的研究较多，但对鱼腥草抑菌防腐作用的研究甚少。本文在上述基础上探究了鱼腥草柱层析组分对E.coli及Salmonella typhimurium生物膜的抑制作用，同时研讨了在冷藏猪肉贮存过程中的应用，为下一步鱼腥草在食品、医药领域更广泛的应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与设备

鱼腥草，市购。新鲜的原料猪肉（屠宰后12 h以内）去骨前腿肉，购于无锡华润万家超市。

1.2供试菌株及其培养基

大肠杆菌（E.coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），作者所在实验室保存，在LB培养基中37℃培养。LB培养基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，水1 000 mL，pH 7.0。

1.3试剂与设备

试剂为分析纯或色谱纯；全自动酶标仪，紫外分光光度计，DELTA320型针探式自动酸度测试仪。

1.4样品处理

鱼腥草干品与体积分数30%乙醇以1∶15的料液比混合搅拌12 h，经过离心抽滤、原液浓缩，用HPD/100大孔树脂柱层析，分别用3倍柱体积的纯水、体积分数10%乙醇溶液、体积分数30%乙醇溶液和体积分数65%乙醇溶液进行柱层析，取体积分数30%层析液进行浓缩干燥，得到样品柱层析组分，保存待用。

1.5成分分析

将得到的体积分数30%乙醇洗脱的鱼腥草柱层析组分配成1 mg/mL的样品甲醇溶液，过0.45 μm滤膜，进行液质联用分析测量。用Sunfire C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm），甲醇与水（含2 mmol/L乙酸铵，质量分数0.1%甲酸）梯度洗脱，采用电喷雾离子源正离子模式、多反应监测（MRM）模式、外标法进行质谱定量分析，分析时间为12 min［6］。

1.6对生物膜的抑制作用

用24孔平底组织培养板培养细菌生物膜，每孔加入100 μL菌液和2 mL培养基，空白对照孔只加培养液，每株菌作6个复孔，37℃静止培养，取24 h生物膜培养物进行定量分析。每个菌株取3个复孔，吸掉培养物，用无菌磷酸缓冲液冲洗，干燥2 h固定，室温干燥，加入150 μL 0.25 g/L的结晶紫染液，室温染色15 min，用生理盐水冲洗后晾干，每孔加入体积分数95%乙醇150 μL，室温脱色90 min，用酶标仪在波长570 nm下测量吸光度［7-8］。

1.7对E.coli及Salmonella typhimurium生存能力的影响

在以上实验的基础上选取适当的鱼腥草柱层析组分浓度，加入试管培养24 h后取出静置一段时间，观察试管中液体的澄清度，澄清透明组浓度即为最小抑菌浓度［9-10］。

1.8对冷藏猪肉保鲜效果的影响

事先用体积分数75%酒精棉球擦拭刀具和案板，将购回的肉去掉筋膜，切成约100 g左右的肉块，随机分为对照组和鱼腥草柱层析组分组，每组24块。将3组的肉块分别浸入无菌蒸馏水和配好的2.0、4.0 mg/mL的体积分数30%乙醇洗脱的鱼腥草柱层析组分的溶液中1 min，取出自然沥干5 min，然后用保鲜膜包装，放在（3±1）℃温度冰箱贮存。将处理后的样品分别在0、3、6、9、12、15、18、21 d测定下列各项指标［11-16］。

1.8.1感官品质测定通过感觉器官，主要观察肉样表面和切面的状态，如色泽、黏度、弹性、气味等状况，并做出判定。参照GB2706-94中猪肉感官指标进行实验。根据色泽、组织状态、黏度、气味、煮沸后肉汤5项指标综合评定。并采纳Williams介绍的9点评分法作评分。本实验取6分及6分以上为消费者可接收的肉样，即是否达到6分为肉样货架寿命终点。

1.8.2微生物指标测定在超净台内取25 g肉样置于灭菌研钵内，充分研磨后加灭菌生理盐水转移至三角瓶中，充分振荡制成体积比1∶10的稀释液，用灭菌移液管吸取稀释液再次配制成体积比1∶100以及体积比1∶1 000的稀释液并如此每次递增稀释。根据肉样腐败程度，选择2个适宜的稀释度，吸取200 μL置于固体培养基上，37℃培养2 d，统计菌落数。

1.8.3挥发性盐基总氮（TVB-N）的测定称取肉样5 g置于250 mL的具塞锥形瓶中，加100 mL蒸馏水振荡摇匀30 min，上清液即为样液。按照GB/ T5000.44-96进行，取10 mL样液注入蒸馏装置反应室，再加入10 mL质量分数1%氧化镁溶液，蒸馏10 min，尾端流入硼酸溶液中（按体积比1∶1添加0.1 g/dL甲基红乙醇溶液及0.5 g/dL溴甲酚绿乙醇溶液），吸收液用0.01 mol/L盐酸标准液滴定。

1.8.4汁液流失率每次测量时打开包装袋取出样品称质量，所测质量和原来的质量之差即为汁液流失量。

1.8.5pH的测定采用DELTA320型针探式自动酸度测试仪测试。每次测试肉样3个点，计算平均值，即为肉样在该贮存时间下的pH。

2　结果与分析

2.1成分分析

体积分数30%乙醇洗脱的鱼腥草柱层析组分色谱图如图1所示。

图1　体积分数30%鱼腥草柱层析组分色谱图Fig.1　Chromatogram of Houttuynia cordata eluted by 30%ethanol

峰1，保留时间1.22 min，ESI-MS（m/z）：153［MH］-，其相对分子质量为154，UV λmax=261 nm，并将这些信息与3，4-二羟基苯甲酸标准品的保留时间、质谱进行比较，比较分析两者的紫外光谱，发现化合物1的信息与3，4-二羟基苯甲酸标准品的特征相同，因此化合物1鉴定为3，4-二羟基苯甲酸。

峰2，保留时间1.99 min，ESI-MS（m/z）：353［MH］-，其相对分子质量为354，UV λmax=326 nm，保留时间、质谱、紫外光谱信息与标准品绿原酸的特征相同，并且有特征碎片离子m/z 191，因此化合物2可鉴定为绿原酸。

峰3，保留时间3.97 min，ESI-MS（m/z）：609［MH］-，其相对分子质量为610，UV λmax=353 nm，保留时间、质谱、紫外光谱信息与标准品芦丁的特征相同，结合碎片离子m/z 463，可鉴定化合物3为芦丁。

峰4，保留时间4.06 min，ESI-MS（m/z）：463［MH］-，其相对分子质量为464，UV λmax=360 nm，保留时间、质谱、紫外光谱信息与标准品金丝桃苷的特征相同，因此化合物4鉴定为金丝桃苷。

峰5，保留时间4.82 min，ESI-MS（m/z）：447［MH］-，其相对分子质量为448，UV λmax=326 nm，保留时间、质谱、紫外光谱信息与标准品槲皮苷的特征相同，因此化合物5鉴定为槲皮苷。

峰6，保留时间4.82 min，ESI-MS（m/z）：301［MH］-，其相对分子质量为302，UV λmax=256、371 nm，保留时间、质谱、紫外光谱信息与标准品槲皮素的特征相同，结合特征碎片离子m/z 267、229，可鉴定化合物6为槲皮素。

2.2对生物膜形成的抑制作用

将鱼腥草柱层析组分溶解于蒸馏水中，测定其对E.coli及Salmonella typhimurium生物膜形成的影响，最终质量浓度分别定为1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL，以蒸馏水为对照，结果如图2所示。

图2　不同质量浓度鱼腥草组分对细菌生物膜的抑制率Fig.2　Inhibition rate of bacterial biofilm by different concentrations of H.cordata fractions

可以看出，随着鱼腥草柱层析组分质量浓度的增加，对两种细菌生物膜形成的抑制率也逐渐升高。并且当柱层析组分最终质量浓度为3.0 mg/mL时，对E.coli生物膜形成的抑制率为100%。最终质量浓度为4.0 mg/mL时，对Salmonella typhimurium生物膜形成的抑制率也为100%。

2.3对E.coli和Salmonella typhimurium生存能力的影响

通过测定体积分数30%乙醇洗脱的鱼腥草柱层析组分对两种细菌的MIC（最低抑菌质量浓度），发现对Salmonella typhimurium的MIC为4.0 mg/mL，对E.coli的MIC为3.0 mg/mL。

2.4对冷藏猪肉保鲜效果的影响

2.4.1肉样整体感官品质的变化经过鱼腥草柱层析组分处理的肉样和未经处理的肉样在贮存期间整体感官品质变化如表1所示。

表1　鱼腥草柱层析组分对肉样整体感官品质评分的影响Table 1　Sense effects of three samples by different concentrations of H.cordata fractions

从表1可以看出，3组肉样整体感官评分均随贮存期的增长而下降。其中各组在0 d感官评分区别不大，4.0 mg/mL组由于其添加柱层析组分浓度较大，导致色泽变暗。另外可以发现，对照组货架期为9 d，而鱼腥草作用后2.0 mg/mL组仍为9 d，4.0 mg/mL组为12 d，总体感官品质评分（包括色泽、组织状态、黏度和气味）稍高于对照组，但添加鱼腥草组分对肉样色泽以及气味均有不利影响。2.4.2肉样微生物含量的变化经过鱼腥草柱层析组分处理后的肉样以及未经处理肉样在贮存过程中微生物含量的变化如图3所示。可以看到，肉样在贮存过程中微生物的含量整体呈现上升的趋势，同时鱼腥草柱层析组分对微生物有明显的抑制作用，而且柱层析组分质量浓度升高对抑制效果有积极作用。在21 d的时候，对照组细菌总数对数值为9.74，2.0 mg/mL组为9.28，4.0 mg/mL组为7.59。此时在4.0 mg/mL鱼腥草柱层析组分中浸泡的肉样刚超过7（冷藏肉腐败的极限值）。

2.4.3挥发性盐基总氮（TVB-N）的变化经过鱼腥草柱层析组分处理后的肉样及未经处理肉样在贮存过程中TVB-N值的变化如图4所示。可以看出，在6 d以后3组肉样中TVB-N值都开始快速增加，到21 d对照组中TVB-N值达到103.21 mg/hg，而添加鱼腥草柱层析组分的两组明显小于对照组，这说明鱼腥草柱层析组分的保鲜效果明显。

图3　冷藏猪肉在冷藏过程中微生物含量的变化Fig.3　Changes of the bacteria counts of chilled pork during the storage

图4　冷藏猪肉在冷藏过程中TVB-N值的变化Fig.4　Change of the TVB-Nvalue of chilled pork during the storage

2.4.4汁液流失率的变化经过鱼腥草柱层析组分处理后的肉样以及未经处理肉样在贮存过程中汁液流失率的变化如图5所示。

图5　冷藏猪肉在冷藏过程中汁液流失率的变化Fig.5　Changes of the drop loss of chilled pork during the storage

可以看出，肉样随着贮存时间的增加汁液流失率亦在不断上升，即加入鱼腥草柱层析组分并没有对其产生减缓作用，可能是由于鱼腥草柱层析组分导致肌肉组织外部渗透压高，使部分水分流出组织，因而比对照组汁液流失率更高些。

2.4.5肉样pH的变化经过鱼腥草柱层析组分处理后的肉样以及未经处理肉样在贮存过程中pH的变化如图6所示。可以看出，pH在贮存过程中出现整体升高的走势。与对照组对比，加鱼腥草柱层析组分组的样品pH在升高过程中明显趋缓，这说明鱼腥草柱层析组分保鲜效果明显。肉样贮存过程中，由于其自身的成熟过程，肉组织细胞中产生部分乳酸、磷酸等酸性物质，致使刚开始pH变化不大甚至有所降低，但随着贮存时间的增加，肉样中的腐败菌以葡萄糖、氨基酸、乳酸等为底物，代谢产生了硫化物、分子胺类物质以及挥发性氨，导致肉样pH升高［13］。鱼腥草柱层析组分的添加明显减缓了肉样pH的上升速度，因此鱼腥草柱层析组分对冷藏猪肉保鲜过程中的pH有积极作用。

图6　冷藏猪肉在冷藏过程中pH的变化Fig.6　Changes of the pH of chilled pork during the storage

3　结语

研究了鱼腥草柱层析组分对E.coli及Salmonella typhimurium生物膜的抑制作用，发现其能够显著抑制这两种细菌生物膜的形成，而且能够完全抑制两种菌的生长。同时，通过研究鱼腥草组分对冷藏猪肉贮存期间各项保鲜指标的影响，发现有较好的保鲜效果，但各项指标的变化趋势不同。其中微生物含量变化和TVB-N值变化最能反映冷藏猪肉贮存过程中的腐败状况。3，4-二羟基苯甲酸、绿原酸与芦丁被证明具有良好的抑菌效果，因此可以推断这3种成分是在冷藏猪肉贮存过程中起保鲜作用的主要成分［17］。鱼腥草是一种常见的蔬菜，其组分对致病菌的生存及其生物膜形成具有良好的抑制效果。因此，作为一种安全无毒副作用的抑菌防腐剂，鱼腥草柱层析组分在肉制品等食品保藏中会有很强的应用价值。

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Components of Houttuynia conrdata on the Inhibition of Bacterial Biofilm and Its Application

LI Cheng1，2，LOU Zaixiang1，2，WANG Hongxin1，2
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Functional Food Engineering Technology Research Center，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The inhibition of bacterial biofilm activity by 30%ethanol elution of Houttuynia cordata was studied.The results showed that the inhibition rates of E.coli and Salmonella typhimurium biofilms were up to 100%when the extract concentration of H.cordata was 4.0 mg/mL.At the same time，the growth of E.coli and S.typhimurium were inhibited by H.cordata extract when its concentrations were 3.0 and 4.0 mg/mL，respectively.Further analysis of its extracts showed that 3，4-dihydroxy benzoic acid，chlorogenic acid，rutin，hyperin，quercetin，and quercetin were its main components.Meanwhile，the effect of preservation of chilled pork by the extracts of H.cordata were also studied.The results exhibited that the microbial content，volatile base nitrogen（TVB-N），pH and SAP turnover rate all had positive effects after the addition of the extractions.The total number of bacteria in per gram of the pork treated by 4.0 mg/mL extract was 5.95 at 15th d，while the control group was 8.01.The results suggested that the extraction of H.cordata had potential applications in chilled pork during storage.

Houttuynia cordata，biofilm，activity，chilled pork，preservation

TS 202；TS 205

A

1673—1689（2016）03—0284—06

2014-12-29

国家自然科学基金项目（31201433）。

王洪新（1964—），男，江苏徐州人，教授，博士研究生导师，主要从事食品功能因子和功能食品研究开发。

E-mail：hxwang@jiangnan.edu.cn