易错PCR提高粘质沙雷氏菌磷脂酶A1活性

王玉满，薛正莲，王　洲，苏燕南，朱　昊（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖　241000）

易错PCR提高粘质沙雷氏菌磷脂酶A1活性

王玉满，薛正莲∗，王洲，苏燕南，朱昊
（安徽工程大学生物与化学工程学院，安徽芜湖241000）

利用易错PCR技术对来自粘质沙雷氏菌PL-06的磷脂酶A1基因plaB进行定向改造，通过引入不同浓度Mg2+、Mn2+得到的易错PCR产物与表达型质粒p ET-28a（+）重组，构建磷脂酶A1突变文库，筛选出高酶活突变株EPB8.该突变酶相对野生酶酶活提高了22.5%，并对突变株EPB8产酶条件进行优化，优化后酶活较野生酶酶活提高41%.序列分析表明：plaB基因有11个碱基发生突变，导致7个氨基酸发生突变，其中磷脂酶A1蛋白有3个氨基酸突变，分别是Y97C、P98S、X228L，辅助蛋白有4个氨基酸突变，分别是P46L、Q58L、N136D、H233R.该实验结果为进一步在分子水平定向提高磷脂酶A1的活性奠定了基础，也为该酶在其他高表达系统中的表达提供了素材.

粘质沙雷氏菌；磷脂酶A1；易错PCR；产酶条件优化

磷脂酶A1是一类专一水解磷脂sn-1位酰基产生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶类［1］，可以用于植物脱胶和磷脂改性方面［2］，其水解产物溶血磷脂是优良的乳化剂、食品添加剂和抗菌剂，广泛运用在食品、化妆品、医药等各个方面［3］.随着磷脂酶的工业应用广泛，对其研究也日益增多.由于自然界筛选的菌株酶活不高、产量低，需进一步提高.随着分子技术水平的提高，与磷脂酶克隆表达相关的报道也随之增多.Michael Givskov［4］等提取液化沙雷氏菌磷脂酶A1基因在大肠杆菌克隆表达，但酶活不到1 U/m L.Jae Kwang Song［5］等构建基因文库成功克隆Serratia sp.MK中磷脂酶A1基因，并在大肠杆菌中表达，但表达量最高为2.21 ug/m L培养基.付建红［6］等将Serratia sp.xiF1内的磷脂酶A1基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达，在毕赤酵母中表达的重组酶在3.7 L发酵罐中磷脂酶A1活力达41.8 U/m L.但这些还不能满足工业应用的需求，因此，通过蛋白质工程手段对磷脂酶进行体外分子改造提高酶活性、稳定性及其产量具有重要意义.由于还未知磷脂酶的空间结构与功能的关系，故研究采用易错PCR技术改造磷脂酶的分子结构.易错PCR可以体外筛选突变蛋白达到迅速提高酶活力的目的，同时改善酶的一系列性质［7］.王颖秋［8］等运用易错PCR方法提高了头孢菌素C酰化酶活力.刘韩［9］等运用易错PCR方法提高土芽孢杆菌ZH1羧酸酯酶的热稳定性.Stephens［10］等运用易错PCR方法改善了真菌木聚糖酶的耐碱性和耐热性.研究以粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板，扩增得到含辅助蛋白的磷脂酶A1基因plaB为研究对象，以期通过易错PCR法提高酶活.

1　材料与方法

1.1材料

（1）菌株和质粒.粘质沙雷氏菌PL-06由安徽工程大学微生物实验室筛选保存；宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）、JM109、质粒pET-28a由安徽工程大学微生物实验室保存；工程菌BP28/BL21（plaB-p ET-28a/ BL21（DE3））由安徽工程大学微生物实验室构建保存.

（2）酶和试剂.PCR系列试剂、质粒DNA小量抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、酶等购自上海生工生物工程技术服务有限公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、T4 Ligase、限制性内切酶购自Thermo，其他试剂均为国产分析纯；引物合成由上海英潍捷基贸易有限公司合成.

（3）培养基.LB培养基：酵母粉5 g（0.5%）、胰蛋白胨10 g（1%）、NaCl 10 g（1%）加水至1 L，p H调至7.0，固体培养基加入2%琼脂粉；PLB培养基：卵磷脂20 g（2%）、胰蛋白胨10 g（1%）、NaCl 10 g（1%）、酵母粉5 g（0.5%）、0.02%溴甲酚紫（3%）、25 mmol/L CaCl2、1 000 m L蒸馏水，p H调至7.0；卵磷脂用高速匀浆机乳化后单独灭菌，固体培养基加入2%琼脂粉；卡那霉素（Kna）储存质量浓度为50 mg/m L，其工作质量浓度为50 ug/m L.

1.2方法

（1）易错PCR法扩增磷脂酶A1（plaB）基因.以粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板，利用易错PCR对目的基因引入突变，目的基因的上游引物：（划线部位为Bam HⅠ的酶切位点），下游引物为（划线部分为HindⅢ的酶切位点）.50 u L的易错PCR反应体系：5 u L 10×PCR Buffer（无Mg2+）、7 mmol/L MgCl2、0.1 mmol/L MnCl2、5 U Taq DNA Polymerase、上下游引物各10 pmol、模板DNA 20 ng，补dd H2O至50 u L.反应程序为95℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃2 min，72℃8 min，35个循环，PCR产物检测后并回收，进行下一步实验.

（2）突变文库的构建.将纯化后易错PCR产物和载体pET-28a质粒用限制性内切酶Bam HⅠ、HindⅢ进行消化，经过T4连接酶连接后，随即转入宿主菌JM109感受态细胞中，涂布于带有卡那霉素（50 ug/m L）的LB平板上，37℃倒置培养12～16 h.将平板上长出的菌落接种至含有卡那霉素（50 ug/m L）培养液的LB培养基中，37℃培养12 h后提取质粒，利用化学转化法转入宿主菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含有卡那霉素（50 ug/m L）的PLB平板上，37℃倒置培养12～16 h，构建突变文库.

（3）磷脂酶A1酶活突变株的初筛.PLB平板含有卵磷脂、溴甲酚紫和CaCl2，可作为筛选平板，产磷脂酶克隆会出现水解晕圈，将含有磷脂酶A1基因plaB重组质粒的工程菌BL21（DE3）点种在筛选平板上作为对照，根据圈径比的大小，初步筛选出正向突变株.

（4）目的菌株的复筛及鉴定.将初筛得到的单菌落接种至5 m L含有卡那霉素（50 ug/m L）培养液的LB培养基中，37℃、200 r/min培养12 h，培养物按2%的接种量接至100 m L含有卡那霉素的LB培养液中，37℃、200 r/min培养至菌浓为OD600=0.6（对数生长期）时，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，37℃诱导4 h，取发酵液，采用酸碱滴定法［11］.酶活力定义为：在45℃和p H 6.0条件下，1 g固体酶粉（或1 m L液体酶）1 min水解磷脂产生1μmol的可滴定脂肪酸，即为1个酶活力单位（U/g或U/m L）［12］，测定发酵液酶活.选取酶活提高的菌株，提取其质粒经限制性酶酶切验证后进行测序分析.

（5）突变菌株EPB8诱导生长曲线的测定.从平板上挑取P28（p ET-28a（+）/BL21（DE3））、BP28（BP28/BL21（DE3））、EPB8单菌落，接种于5 m L含卡那霉素（50 ug/m L）的LB培养液中，37℃、200 r/min过夜培养.1%的接种量，转接至100 m L含卡那霉素（50 ug/m L）的LB培养液的250 m L三角瓶中，37℃、200 r/min培养3～4 h，OD600为0.6时加入终浓度为0.2 mmol/L IPTG开始计时，每隔1 h取样测OD600值，记录数据绘制生长曲线.

（6）EPB8诱导产酶条件的优化.接种1 m L过夜活化的EPB8菌液至100 m L LB培养基中，分别从诱导时间、诱导温度、加入IPTG时的OD600值、IPTG浓度4个方面对EPB8进行产酶条件优化［12］.诱导时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h；诱导温度分别为22℃、27℃、32℃、37℃、42℃；加入IPTG时的OD600值分别为0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2；IPTG加量分别为0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、0.7 mmol/L、1.0 mmol/L；诱导后进行酶活定量测定.初始时IPTG加量0.2 mmol/L、温度37℃、OD600值0.6条件下进行优化即可.

2　结果与分析

2.1目的基因的获得

将粘质沙雷氏菌PL-06接种至5 m L的LB培养液中，37℃、200 r/min培养12～16 h，所得菌液按照基因组提取试剂盒说明步骤进行操作，得到的基因组用1%琼脂糖凝胶验证进行.

2.2易错PCR条件的确定

由于Mg2+可以稳定非互补碱基对，因此增加Mg2+浓度使之超过正常用量，从而稳定非互补的碱基对.而Mn2+能够降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率［13］.研究通过改变Mg2+浓度和添加Mn2+促进碱基的错配，获得多样性突变文库.采用Mg2+浓度为1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L、7 mmol/L，Mn2+浓度为0、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、1 mmol/L作为梯度进行易错PCR.

不同离子浓度下的易错PCR如图1所示.由图1可知，随着Mn2+浓度的增加，目的基因扩增量减少，条带弥散性也较严重，所以最适Mn2+浓度为0.1 mmol/L.在最适Mn2+浓度下，Mg2+浓度过低，扩增效率低，甚至没有条带，若Mg2+浓度较低，突变率会较低［14］，因而选择较高的Mg2+浓度7 mmol/L.不仅如此，条件6组合浓度基因平均突变率为0.58%，条件8组合浓度为0.63%，所以最终选择Mg2+浓度为7 mmol/L、Mn2+浓度为0.1 mmol/L，从而实现对目的基因突变率的有效地控制.

图1　不同离子浓度下的易错PCR

2.3基因文库的构建

按照上述易错PCR的条件，以基因组为模板扩增目的基因，大小约1 700 bp，易错PCR扩增目的基因如图2所示.经胶回收后，同时和载体pET-28a进行双酶切后连接，转化宿主菌大肠杆菌JM109感受态细胞中得到的转化子构成突变文库.

2.4突变株的筛选

（1）初筛.将文库中的转化子接种至LB培养液中混合过夜培养，提取质粒并转化至宿主菌大肠杆菌BL21（DE）感受态细胞中，涂布在含卡那霉素的PLB平板上，37℃培养12～14 h后，利用磷脂酶A1可以分解卵磷脂在PLB平板产生水解晕圈，根据水解晕圈的大小及其产生的快慢，可以直观地筛选酶活突变株.将筛选出酶活发生变化的突变株点种在含卡那霉素的PLB平板上，与BP28/BL21（简称BP28）比较晕圈大小，结果如图3所示.由图3可知，挑取圈径比较大的突变子6#、8#、16#、18#、19#、21#，在此基础上进一步复筛.

图2　易错PCR扩增目的基因

图3　PLB平板筛选结果

（2）复筛.将初筛得到的酶活改变的突变株接种至含有50 ug/m L卡那霉素的LB培养中，37℃、200 r/min进行培养至OD600为0.6时，加IPTG诱导4 h，测发酵液粗酶液酶活进行复筛，结果如图4所示.由图4可知，酶活都有所提高，但8#突变子提高幅度最大，酶活为19.6 U/m L.为进一步验证突变子的正确性，对其提取质粒进行单酶切验证，结果如图5所示.从图5中可以看出，突变株单酶切的大小约为7 000 bp和质粒（约5 300 bp）与目的基因（约1 700 bp）共同片段的大小相一致.条带大小正确说明突变子构建成功，并命名为EPB8以备下一步实验.

2.5突变基因的序列分析

提取突变株的重组质粒经PCR及酶切验证正确后，送上海生工生物有限公司进行测序.对比测序结果并分析突变率，找出碱基突变和相应氨基酸突变位点.

突变基因的序列分析表明，突变菌株EPB8有11个碱基发生突变，导致有7个氨基酸发生突变.其中，磷脂酶A1蛋白有3个氨基酸突变，分别是Y97C、P98S、X228L；辅助蛋白有4个氨基酸突变，分别是P46L、Q58L、N136D、H233R.

2.6突变株EPB8诱导生长曲线的测定

按1.2（5）所述方法进行诱导生长曲线的测定，结果如图6所示.由图6可知，BP28和突变株EPB8在未诱导的情况下，生长情况基本相一致.但加入IPTG诱导后，两菌株生长均表现出受到抑制.一方面IPTG对菌体有一定毒害作用；另一方面，目的产物磷脂酶A1对细胞也有一定的毒性［12］.

图4　突变株摇瓶酶活测定

图5　突变菌株的酶切图谱

图6　EPB8突变株的诱导生长曲线

2.7突变菌株EPB8产酶条件的优化

（1）诱导时间对产酶的影响.按1.2（6）所述方法进行测定，结果如图7所示.由图7可知，诱导时间2 h时酶活性最高，随着时间的延长，酶活性有所降低，可能IPTG和磷脂酶A1对菌体都有一定毒害作用.诱导时间不宜过长，过长则菌体可能发生自溶，从而影响目的产物表达.故EPB8菌株最佳诱导时间为2 h.

（2）诱导温度对产酶的影响.诱导温度对目的产物的表达及酶活有着至关重要的作用，若诱导温度过高，重组蛋白会形成大量的无活性包涵体，以致胞外酶活降低；温度过低，影响菌体生长，从而影响重组蛋白的表达.按照1.2（6）所述方法进行测定，诱导2 h测定发酵液酶活，结果如图8所示.由图8可知，诱导温度为37℃时，酶活性最高，诱导温度过高或过低，酶活性都会降低，所以，最佳诱导温度为37℃.

（3）诱导起始OD600对产酶的影响.诱导起始OD600对菌体产酶有着较大影响，按照1.2（6）所述方法测定，诱导温度为37℃、诱导时间2 h后测定发酵液酶活，结果如图9所示.由图9可知，诱导时间过早，菌体生长缓慢且菌体量少，外源蛋白的表达量可能会降低，酶活性也不高；若诱导时间过迟，细菌自身代谢能力降低，不利于外源基因表达，酶活性也是相对较低.当OD600为0.8时诱导，磷脂酶A1活性最高，诱导起始OD600过高过低都会影响酶活，所以最佳诱导起始OD600为0.8.

（4）IPTG诱导浓度对产酶的影响.按照1.2（6）所述方法确定IPTG最佳诱导浓度，诱导温度为37℃、诱导起始OD600为0.8、诱导2 h后测定发酵液粗酶活，结果如图10所示.由图10可知，IPTG浓度为0.3 mmol/L时，酶活性最高，IPTG作为诱导剂能启动lac启动子的转录，使目的基因得以表达［12］；IPTG浓度＞0.3 mmol/L时，酶活性降低，可能是IPTG本身对细胞具有一定的毒性，对菌体生长有一定抑制作用，导致蛋白质产量降低；IPTG浓度＜0.3 mmol/L时，酶活性也降低.因此，确定最佳的IPTG诱导浓度为0.3 mmol/L.

图7　诱导时间对酶活的影响

图8　温度对酶活的影响

图9　诱导OD600对酶活的影响

图10　IPTG浓度对酶活的影响

3　结论与讨论

研究确定了易错PCR条件：Mg2+浓度为7 mmol/L、Mn2+浓度为0.1 mmol/L，成功构建了突变文库.通过筛选最后得到酶活提高的突变株EPB8，该突变株最初酶活性测定为19.6 U/m L，相对于未突变前菌株BP28的酶活16 U/m L提高了22.5%，通过进行单因素实验优化，优化后的酶活达22.5 U/m L，比优化前提高了14.8%.

粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因plaB经易错PCR方法的定向改造后，磷脂酶A1活性有了较大提高，为后期磷脂酶结构与功能的关系研究提供了一定的素材.突变株EPB8经测序分析表明：有7个氨基酸发生突变，其中288位由X突变为L，与之前推断的第195位Ser为此磷脂酶A1的催化中心相距较近，这也可能是酶活提高的原因之一；而亮氨酸又为疏水性氨基酸，疏水性氨基酸在蛋白质内部，具有保持蛋白质的三级结构的作用，288位氨基酸的突变可能会使磷脂酶A1的三级结构更加稳定，这也为磷脂酶A1的研究奠定了一定的基础.

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Improving the Activity of Phospholipase A1 from Serratia Marcescs PL-06 by Error-prone PCR

WANG Yu-man，XUE Zheng-lian∗，WANG Zhou，SU Yan-nan，ZHU Hao
（College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

In order to obtain phospholipase A1 with higher activity，error-prone PCR was used to evolve the phospholipase A1 from Serratia marcescens PL-06 by adding different concentration of Mg2+and Mn2+.The gene was cloned into p ET28a（+）expression vector，and a mutant library was constructed.After the first and secondary screening，one mutant showed significant elevated activity，named EPB8.The enzyme activity of the mutants was 22.5%higher than that of the wild-type control.And increased by 41%after optimal Fermentation conditions.The sequence of the plaB gene of the mutants showed 7 mutated amino acids.It was found that phospholipase A1 protein revealed three amino acid substitutions：Y97C，P98S，X228L，and auxiliary protein revealed four amino acid substitutions：P46L，Q58L，N136D，H233R.These results provide a basis for further research of phospholipase A1.

Serratia marcescens；phospholipase A1；error-prone PCR；optimization of fermentation conditions

Q786

A

1672-2477（2016）04-0006-06

2016-01-10

国家自然科学基金资助项目（31471615）

王玉满（1989-），女，山东成武人，硕士研究生.

薛正莲（1967-），女，安徽和县人，教授，硕导.