用RT-PCR检测海兰褐蛋鸡禽戊型肝炎病毒

杨树青，孙　嘉，孔祥伟，贠鲁祥，孙淑红

(山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)



用RT-PCR检测海兰褐蛋鸡禽戊型肝炎病毒

杨树青，孙嘉，孔祥伟，贠鲁祥，孙淑红*

(山东农业大学动物科技学院，泰安 271018)

为证实我国蛋鸡群中存在禽戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)，从患有大肝大脾病的某海兰褐蛋鸡群采集粪便样品40份、血浆样品10份。提取RNA后，进行禽HEVORF2基因片段的RT-PCR(reverse transcription PCR)检测，阳性样品进行克隆测序。同时采集疑似HEV感染鸡的肝，在两周龄SPF鸡进行了人工接种试验。结果表明，来自海兰褐蛋鸡群的40份粪便和10份血浆样品中，27份粪便样品和4份血浆样品为禽HEV RNA阳性。随机选取两个阳性样品的序列进行分析，其与国内外参考序列相似性为78.1%～98.3%。进化树分析显示与中国、欧洲参考株在同一分支，属于禽HEV基因3型。人工接种试验结果显示，接种后14 d的SPF鸡肝中均鉴定出HEV RNA阳性(4/4)。我国蛋鸡群存在基因3型禽HEV。本研究首次发现并报道国内蛋鸡存在禽HEV，这为进一步了解禽HEV在我国鸡群的流行状况及其危害提供了依据。

禽戊型肝炎病毒(HEV)；海兰褐蛋鸡；大肝大脾病(BLS)；基因3型

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)属于肝炎病毒属，是一种无囊膜、单股正链RNA病毒。禽HEV分为4个基因型，其中，澳大利亚和韩国株为基因1型，美国原型株和无毒株为基因2型，欧洲和中国株为基因3型，中国台湾株和匈牙利株为基因4型[1-4]。禽HEV是引起家禽大肝大脾病和肝脾肿大综合征的主要病原[5-7]，主要感染30～72周龄的产蛋鸡和肉种鸡，造成产蛋率下降和死淘率升高，给生产效益造成损失。1997年杨德吉等证实了我国鸡群中存在大肝大脾病病毒(big liver and spleen disease virus，BLSV)抗体[8]，2007年梁久红等调查我国南方的鸡群，发现禽HEV血清抗体阳性率为33%[7]，2008年张璐等对广东、山东和黑龙江三个地区健康鸡血清的禽HEV 抗体进行调查，阳性率为28.3%，而表现肝脾、肿大鸡的血清阳性率为43.3%[9]。2005年马玉玲等利用RT-PCR方法从南京某鸡场扩增获得了一小段BLSV的核酸序列[10]，但并没有后续的相关报道。2010年赵钦等从肉种鸡中分离到禽HEV，首次证实了我国肉种鸡中存在禽HEV，并且证明为禽HEV基因3型[11]。在国外，已报道禽HEV感染蛋鸡群并引起发病，并带来较大经济损失[12-13]，但在国内还未有蛋鸡存在禽HEV的报道。为证实国内蛋鸡群是否存在禽HEV，作者对患有大肝大脾病的某海兰褐蛋鸡群采集了粪便、血液样品等进行了RT-PCR检测，旨在鉴定禽HEV，并进一步了解其在蛋鸡群流行情况及危害提供一定的实验室依据。

1　材料方法

1.1主要仪器和试剂

RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒来自Biomiga公司，反转录试剂盒来自Abm公司，TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker、pMD18-T载体、感受态细胞购自TaKaRa公司。其他常规试剂均为国产分析纯。

1.2临床病例与样品采集

江苏省某27周龄海兰褐蛋鸡群表现出患大肝大脾病的典型症状，食欲不振、精神萎靡，产蛋率下降及死淘率增加。对部分病鸡进行剖检，观察发现肝、脾严重肿大，少数发病鸡出现黄疸，卵巢退化等病变。分别从两个鸡舍随机采集40份粪便与10份血浆，并采集疑似HEV感染鸡的肝。

1.3粪便和血浆样品中禽HEV RNA的提取与RT-PCR的扩增

1.3.1RNA提取及RT-PCR的扩增按照RNA提取试剂盒说明书，对粪便、血浆样品进行RNA提取。按照反转录试剂说明书进行反转录得到cDNA。

根据文献[11]报道，设计禽HEVORF2引物序列。外侧引物序列为5′-TCGCCTGGTAATACAAATGC-3′和5′-GCGTTCCCGACAGGTCGG-CC-3′；内侧引物序列为5′-ACAAATGCTAGGG-TCACCCG-3′和5′-ATGTACTGACCACTGGCC-GC-3′。外侧引物目的扩增片段为278 bp，内侧引物目的扩增片段为242 bp。

以cDNA为模板，使用外侧引物进行第一次PCR扩增，PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、53 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，31个循环；72 ℃ 10 min。以第一次PCR产物为模板，使用内侧引物进行第二次PCR扩增，PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、57 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，31个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.3.2阳性样品的克隆、测序随机选取2个海兰褐蛋鸡粪便阳性样品，用胶回收试剂盒进行回收。与pMD-18T载体连接后，转化到大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆送博尚生物技术(上海)有限公司测序。1.3.3禽HEVORF2基因序列的同源性比较与基因型分析将获得的HLHDJ1和HLHDJ2序列与8个国内外经典参考株(澳大利亚株AM943647、韩国株JN597006、美国原型株AY535004、美国无毒株EF206691、欧洲株AM943646、中国株GU954430、匈牙利株JN997392、中国台湾株KF511797)进行同源性比较和进化树分析，鉴定其基因型。

1.4HEV RNA阳性样品人工接种两周龄SPF鸡

取HEV RNA阳性鸡的肝1 g与4 mL PBS缓冲液混合研磨并过滤，肝悬液采用翅静脉注射的方式，按0.1 mL·只-1的剂量人工接种4只两周龄SPF鸡。饲养至14 d采集肝，提取RNA并反转录，再进行HEV RNA的RT-PCR鉴定。

2　结　果

2.1RT-PCR扩增结果

海兰褐蛋鸡的40份粪便样品中，27个样品扩增出250 bp左右的目的条带；10份血浆样品中，4个样品扩增出250 bp左右的目的条带。图1显示为部分样品的电泳结果。

M.DL2000相对分子质量标准；1～11.部分样品；12.阴性对照；13.阳性对照M.DL2000 marker；1-11.Samples；12.Negative control；13.Positive control图1　样品RT-PCR产物电泳结果Fig.1 Amplification of HEV gene from samples by RT-PCR

2.2两个禽HEVORF2基因序列的同源性比较

随机挑取的两个阳性样品编号为HLHDJ1、HLHDJ2，测序结果显示均为242 bp的禽HEVORF2基因片段，两个样品之间的序列相似性为99.6%。与其他8个国内外经典参考株的相似性为78.1%～98.3%，其中与欧洲参考株和中国参考株同源性最高，相似性在96.3%～98.3%。而与美国无毒株相比，相似性最低，仅为78.1%～78.5%(图2)。

图2　两株禽HEV部分ORF2基因序列与国内外参考株同源性比较Fig.2　Homology comparison of two avian HEV partial ORF2 sequence and reference strains

2.3两个禽HEV ORF2基因序列的基因型分析

基因进化树显示，HLHDJ1、HLHDJ2与中国参考株GU954430和欧洲参考株AM943646在同一分支(图3)。该结果表明，2个来自国内海兰褐蛋鸡群的禽HEV株属于基因3型。

2.4人工接种两周龄SPF鸡的RT-PCR检测

用禽戊型肝炎病毒阳性样本接种4只SPF鸡，饲养至14 d，无任何临床症状。同时，采集4份肝样品，RT-PCR方法均检测到250 bp大小的目的条带。该检测结果表明，海兰褐蛋鸡样品中禽HEV具有传染性。

3　讨　论

禽HEV主要感染30～72周龄的产蛋鸡和肉种鸡，造成产蛋率下降和死淘率升高。美国等已报道禽HEV感染蛋鸡群并引起发病，给养禽业带来较大经济损失[12-13]，在我国，2010年赵钦等从我国饲养的肉种鸡中鉴定出禽HEV，并证实了我国肉鸡群中存在基因3型的禽HEV[11]。此前，梁久红等仅完成了禽HEV抗体的检测，证明了我国鸡群禽HEV抗体阳性[7]。本研究证实了国内海兰褐蛋鸡群存在禽HEV，这是首次发现国内蛋鸡群存在禽HEV并报道。同时发现，来自海兰褐蛋鸡的2株禽HEV的序列相似性高达99.6%，并同为基因3型，与I.Bilic等提出的禽HEV基因型的地域性特点相符合[6]。

图3　禽HEV部分ORF2基因序列构建的基因进化树Fig.3　Genetic evolution tree based on partial ORF2 sequence of avian HEV strains

Z.F.Sun等使用美国禽HEV成功感染火鸡，证实了禽HEV 可以被其他禽类感染，但是人工感染猪、恒河猴却没有成功[14]。周恩民等人检测2 000多份健康鸭血清，发现抗禽HEV ORF2 抗体的阳性率约为20%[15]，同时，张红霞等对7 000 多份健康青年血清进行禽HEV 特异抗体检测，发现28 份血清为禽HEV抗体阳性[16]。这些试验结果都表明，禽HEV具有跨物种传播的可能性，同时不排除禽HEV具有人畜共患的可能性。

禽HEV通过翅静脉接种SPF 鸡，被接种鸡所产鸡蛋蛋清中可以检测到禽HEV，并且含有禽HEV 的蛋清能够再次成功感染SPF 鸡[17]。感染禽HEV的蛋鸡所生产的鸡蛋中可能存在禽HEV，随着鸡蛋在不同地区的销售、运输等，可能会导致禽HEV的地域性扩散。本研究用疑似HEV感染鸡的肝制备悬液，采用翅静脉注射的方式人工接种两周龄SPF鸡，并在接种后14 d的SPF鸡肝中采用RT-PCR方法检测到HEV RNA阳性。显然，来自海兰褐蛋鸡的HEV RNA阳性样本具有传染性，如进一步在我国蛋鸡群中传播，将可能给养禽业带来新的风险。

4　结　论

发现海兰褐蛋鸡存在基因3型禽HEV，且来自海兰褐蛋鸡的HEV RNA阳性样本具有传染性，这为探明禽HEV在我国鸡群中的传播及其防控提供了一定的理论依据。

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(编辑白永平)

Detection of Avian Hepatitis E Virus in Hailan Brown Layer Chickens

YANG Shu-qing，SUN Jia，KONG Xiang-wei，YUN Lu-xiang，SUN Shu-hong*

(AnimalScienceandTechnologyCollege，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

We aimed to identify the existence of avian hepatitis E virus (HEV) in broiler breeders in China.In the current study，a total of 40 fecal and 10 serum samples were collected from Hailan brown laying hens suffered from the big liver and spleen disease to detect the avian HEVORF2 gene by reverse transcription PCR (RT-PCR).The positive PCR products were cloned and sequenced.Artificial inoculation experiment was carried out on two-week-old SPF chickens with the liver of suspected HEV infected chickens.As the result，27 of 40 fecal samples and 4 of 10 serum samples were detected positive for avian HEV RNA.Sequences analysis revealed that 2 HEV RNA positive samples shared 78.1%-98.3% nucleotide sequence identities to avian HEV strain reported in NCBI.Phylogenetic analysis showed that these avian HEVs related to China and Europe isolates belonged to avian HEV genotype 3.All of four SPF chickens were positive of avian HEV helicase gene RNA at 14 days after intravenous inoculation.These results confirmed the existence of avian HEV infection in laying hens in China，which provide experimental research basis of avian HEV.

avian hepatitis E virus(HEV)；Hailan Brown laying hens；big liver and spleen disease；genotype 3

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.012

2016-02-16

山东省科技发展计划(2014GNC110006)

杨树青(1991-)，男，山东郓城人，硕士生，主要从事禽病学研究， E-mail：601297639@qq.com；孙嘉(1990-)，男，山东青岛人，硕士生，主要从事禽病学研究，E-mail：1137224981@qq.com，二人共为同等贡献作者

孙淑红，教授，主要从事家禽病毒病研究，E-mail: sunshuhong@sdau.edu.cn

S852.659.6

A

0366-6964(2016)08-1618-05