染料木素的抗诱变性检测

邹思颖　张立实.四川省疾病预防控制中心，四川成都　6004；.四川大学华西公共卫生学院，四川成都　6004

染料木素的抗诱变性检测

邹思颖1张立实2
1.四川省疾病预防控制中心，四川成都610041；2.四川大学华西公共卫生学院，四川成都610041

目的 评价染料木素的抗诱变性。方法 培养L5178Y细胞，根据不同的处理方法进行分组，阳性诱变组［染料木素0.078、0.156、0.312、0.625μg/mL 4种剂量分别联合甲基磺酸甲酯（MMS）5μg/mL或丝裂霉素C（MMC）0.5μg/mL］、阳性诱变对照组（MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL）、溶剂对照组（0.5%二甲基亚砜）、阴性对照组（纯水）以及抗诱变阳性对照组（维生素C 100μg/mL+MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL）。通过L5178Y小鼠淋巴瘤细胞实验微孔板法，采用前处理（染料木素先处理细胞3 h，然后MMS或MMC处理3 h）、同时处理（染料木素与MMS或MMC同时处理细胞3 h）和后处理（MMS或MMC先处理细胞3 h，然后染料木素处理3 h）3种处理方式，测定染料木素各剂量组tk位点突变频率，评价染料木素对MMS或MMC诱变性的拮抗作用。 结果 在染料木素抗诱变性检测中，在前处理和后处理条件下，染料木素各剂量组tk位点总突变频率显著低于MMS或MMC阳性诱变对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；在同时处理条件下，染料木素0.312、0.625μg/mL剂量组tk位点总突变频率显著低于MMS或MMC阳性诱变对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。结论 在3种处理方式下，染料木素能有效地抑制MMS和MMC的诱变作用，以前处理方式的抑制作用最强，有良好的开发利用前景。［关键词］染料木素；小鼠淋巴瘤细胞实验；抗诱变性；L5178Y细胞

染料木素是一种从大豆种子中发现的重要营养成分，属于黄酮类植物雌激素，黄酮类植物雌激素是一类具有苯环与色酮环基本结构的化合物。目前研究已发现黄酮类植物雌激素具有多种生理活性作用，对激素依赖性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等有防治作用，同时还具有抗氧化、抗辐射和免疫调节等作用［1-2］。通过流行病学和动物模型研究也发现，染料木素与一系列潜在的有益健康的生理作用有关，其中包括防治乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病和绝经后疾病等［3-5］。

小鼠淋巴瘤细胞实验是一种用于初筛诱变剂和致癌物质的体外实验［6］。目前常用于检测化合物抗诱变性的实验有Ames实验、彗星实验、微核试验、HPRT基因突变实验、染色体畸变实验等，由于这些实验一般仅能检测到单一的遗传毒性效应，故通常需要一组实验以全面评价受试物的遗传毒性。小鼠淋巴瘤细胞实验不仅可以检测出点突变、小缺失、重组等小范围的基因突变，还能检测出包括tk位点在内的大的缺失、染色体畸变等大范围的损伤，因此将小鼠淋巴瘤细胞实验用于诱变性检测具有高灵敏性、检测范围广等优点。目前关于小鼠淋巴瘤细胞实验用于化学物的抗诱变性评价，除本实验室已做过一些相关工作外，其他的研究报道尚不多见。本研究利用小鼠淋巴瘤细胞实验检测染料木素的抗诱变性，一方面为其开发和利用提供安全性依据，另一方面也可为将小鼠淋巴瘤细胞试验应用于抗诱变性检测累积更多的资料。

1　材料与方法

1.1细胞系

L5178Y 3.7.2C tk+/-细胞，由日本国立研究所本间正充提供。

1.2细胞培养

使用含10%马血清，200μg/mL丙酮酸钠，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液培养，培养于37℃，5%二氧化碳（CO2）培养箱中。

1.3受试物

染料木素购于成都市药品生物制品研究所，使用时用二甲基亚砜（DMSO）将其溶解成不同浓度溶液。

1.4染料木素的抗诱变性检测

1.4.1试剂 甲基磺酸甲酯（MMS）、丝裂霉素C（MMC）、RPMI 1640培养基、马血清、三氟胸苷（TFT）、丙酮酸钠、二甲基亚砜（DMSO）、次黄嘌呤、甘氨酸、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷、维生素C（VitC）均购于Sigma公司。

1.4.2剂量设计预实验中，利用MMC作为诱变剂，采用同时处理方式（MMC与染料木素同时作用L5178Y细胞3 h）确定实验剂量。当染料木素为0.625μg/mL时，相对悬浮生长率（RSG）较小，为45%～48%，表现出明显细胞毒性。因为考虑在多数情况下，RSG＞RS，上述处理情况下的RS可能在10%～20%的理想范围内，因此染料木素正式试验的剂量定为0.078、0.156、0.312、0.625μg/mL（阳性诱变组），另外再设一个阳性诱变对照组（MMS 5μg/mL或MMC 0.5μg/mL）、溶剂对照组（0.5%DMSO）和阴性对照组（纯水）以及抗诱变阳性对照组（VitC 100μg/mL+MMS 5μg/mL或MMC0.5μg/mL）。

1.4.3清除自发突变参照文献［7］进行。

1.4.4受试物处理细胞 将L5178Y细胞调至2×105个/mL，每瓶10mL。在抗诱变实验中，采用前处理、同时处理和后处理3种处理方式，按1%加入不同浓度受试物（染料木素）和MMS或MMC。前处理时，先加入受试物处理3 h再加入MMS或MMC处理3 h；同时处理时，受试物和MMS或MMC同时处理细胞3 h；后处理时，先加入MMS或MMC处理3 h再加入受试物处理细胞3 h。处理结束后，1000 r/min离心10min，弃上清液，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI 1640培养液中，并调整细胞密度到2×105个/mL。

1.4.5平板接种效率测定将上述细胞梯度稀释至8个/mL，按每孔0.2 mL接种96孔培养板，每一剂量接种1块平板。于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养14 d后，计数每块培养板有集落生长的孔数，计算第0天的平板接种效率（PE0）。“1.4.4”中剩余细胞继续培养2 d，每天计数并维持细胞密度在1×106个/mL以下。表达培养结束后，按上述PE0方法测定培养2 d的平板接种效率（PE2）。

1.4.6表达培养将“1.4.4”中的剩余细胞调整细胞密度为2×105个/mL，表达培养2 d，同时每隔24 h计数1次，并调整细胞密度为2×105个/mL，计算相对悬浮生长率（RSG）。

1.4.7总突变频率（TMF）测定取经表达培养2 d的细胞，将细胞密度调整为1×104个/mL，按1%加入100× TFT，使其终浓度为3μg/mL，然后将细胞悬液加到96孔板中，每孔加200μL，即每孔有2000个细胞。每个剂量组做2个平行平板，在5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养12 d后，肉眼计数每块平板的集落生长孔数。

1.4.8计算方法PE0和PE2（第0天、第2天平板效率）、RS（相对存活率）、RSG、RTG（相对总生长率）、TMF等计算方法和结果判定标准参照文献［8］。

1.5统计学方法

在英国环境诱变剂学会指南推荐的Mutant（tm）软件中，使用Dunnett t检验对TMF进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

MMS作为诱变剂时，染料木素各剂量组RS、RSG 和RTG高于阳性诱变对照组（MMS 5μg/mL），表明在本实验条件下，染料木素可抑制MMS的细胞毒性作用。在前处理条件下，染料木素各剂量组与阳性诱变对照组比较，TMF降低，差异均有高度统计学意义（P＜0.01），同时染料木素各剂量组TMF低于抗诱变阳性对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。在同时处理条件下，染料木素仅有0.312μg/mL G+MMS组、0.625μg/mL G+MMS组与阳性诱变对照组比较TMF降低，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。在后处理条件下，染料木素各剂量组与阳性诱变对照组比较TMF降低，差异均有高度统计学意义（P＜0.01），同时染料木素0.312、0.625μg/mL剂量组TMF低于抗诱变阳性对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。表明在3种处理条件下染料木素均能抑制MMS的诱变作用。见表1～3。

MMC作为诱变剂时，染料木素各剂量组RS、RSG 和RTG高于阳性诱变对照组（MMC 0.5μg/mL），表明在本实验条件下，染料木素可拮抗MMC的细胞毒性作用。在前处理条件下，染料木素各剂量组与阳性诱变对照组比较TMF降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。在同时处理条件下，染料木素中仅有0.312μg/mL G+MMS组、0.625μg/mL G+MMS组与阳性诱变对照组比较TMF降低，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。在后处理条件下，染料木素各剂量组与阳性诱变对照组比较TMF降低，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）。表明在3种处理条件下染料木素均能削弱MMC的诱变作用。见表4～6。

表1　染料木素前处理时对MMS诱变性的影响

表2　染料木素同时处理时对MMS诱变性的影响

表3　染料木素后处理时对MMS诱变性的影响

表4　染料木素前处理时对MMC诱变性的影响

表5　染料木素同时处理时对MMC诱变性的影响

3　讨论

在本研究中，MMS和MMC这两种具有不同遗传毒性机制的诱变剂被用来研究染料木素对不同类型遗传突变的抗突变作用。MMS是一种直接烷化剂，主要甲基化嘌呤碱基的氮原子，导致碱基不稳定，最终导致染色体重排或重组［9-11］。MMC是一种双功能烷化剂和交联剂，能与脱氧鸟苷碱基形成加合物，诱导产生姐妹染色单体交换和染色体畸变［12-13］。本课题研究结果表明，在本研究条件下染料木素能够降低MMS 和MMC诱导的TMF，并且有剂量效应关系，这表明染料木素具有较强的抗诱变作用。现在已有的研究报道也表明染料木素具有抗诱变性。2001年Yang等［14］利用大肠杆菌回复突变系统研究染料木素的抗诱变作用发现，染料木素有效地抵抗了N-ethyl-N-nitrosourea （ENU）导致的诱变作用，特别是减少了颠换突变。2009年Pugalendhi等［15］发现染料木素在体内试验中能够降低DMBA导致的微核和染色体畸变。

本课题检测染料木素的抗诱变性时使用了前处理、同时处理和后处理3种方式。前处理和后处理实验结果为阳性时，可认为受试物属于生物抗诱变剂，而同时处理实验结果为阳性时，则可认为受试物属于去诱变剂［16］。结果表明，在3种处理方式下，染料木素均能有效地降低tk位点的TMF，而染料木素在前处理条件下抗诱变作用最强，这可能是因为染料木素预孵细胞后可以增强其某些具有清除自由基功能的酶的功能有关。

本课题利用小鼠淋巴瘤细胞实验评价染料木素的抗诱变性作用。实验结果表明，在3种处理条件下，染料木素（0.078～0.625μg/mL）能拮抗MMS和MMC的诱变性且前处理的抗诱变作用较强，提示可能是因为受试物预孵细胞后可增强其某些具有清除自由基功能的酶功能，对细胞氧化损伤的抑制作用可能是其对MMS和MMC诱变性的拮抗作用的机制之一。

表6　染料木素后处理时对MMC诱变性的影响

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Detection of antimutagenic effect of Genistein

ZOU Siying1ZHANG Lishi2

1.Sichuan Center for Disease Control and Prevention，Sichuan Province，Chengdu610041，China；2.West China School of Public Health，Sichuan University，Sichuan Province，Chengdu610041，China

Objective To evaluate the antimutagenic effect of Genistein.Methods L5178Y cells were cultivated，and grouped according to the different processing methods，the L5178Y cells were respectively exposed to the Genistein concentrations of 0.078，0.156，0.312，0.625μg/mL with 5μg/mL methyl methanesulfonate（MMS）or 0.5μg/mL mitomycin C（MMC）（positive mutation group），5μg/mL MMS or 0.5μg/mL MMC（positive mutation control group），0.5% DMSO（solvent control group），water（negative control group），5μg/mLMMS or 0.5μg/mLMMC and 100μg/mL VitC+ 5μg/mLMMSor 0.5μg/mLMMC（anti mutagenesis positive control group）.The antimutagenic effect of genistein were determined by the mouse lymphoma Assay in L5178Y cells，in the evaluation of antimutagenic effect three kinds of treatment（pre-treatment，silmutaneous-treatment and post-treatment）were used to detect the antimutagenic effects of Genistein and puerarin against gene mutations induced by MMS and MMC.Determination of mutant frequency of tk locus（TFT）was performed according to the microcell method.Results In pre-treatment and post-treatment，at all the tested concentrations the total mutation frequencies were lower than the MMS or MMC positive mutation control group the differences were statistically significant（P＜0.01）.In simultaneous treatment，the total mutation frequencies at concentrations of 0.312，0.625μg/mL were lower than MMSand MMC positive mutation control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion Under the three kinds of treatment，Genistein shows a good role for preventing TK gene mutation induced by MMS or MMC，pre-treatment has the strongest inhibitory effect，had a good application and development prospect.

Genistein；Mouse lymphoma Assay；Antimutagenicity；L5178Y cell

R394.6

A

1673-7210（2016）01（c）-0044-04

2015-09-23本文编辑：任念）

邹思颖（1983-），女，博士研究生；研究方向：食品毒理与遗传毒理学。

张立实（1956-），男，教授；研究方向：营养与食品卫生学、毒理学。