生育期金雀异黄素干预对亲代大鼠生育能力的影响

孙晓溪　张云波　郭纪鹏　那晓琳哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江哈尔滨　150081

生育期金雀异黄素干预对亲代大鼠生育能力的影响

孙晓溪张云波郭纪鹏那晓琳
哈尔滨医科大学公共卫生学院，黑龙江哈尔滨150081

目的 探讨生育期金雀异黄素干预对亲代大鼠体重及生育能力的影响。方法 SPF级性成熟8周龄雌雄SD大鼠实验室适应1周后，随机分为4组，分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组以及对照组，每组雌鼠8只，雄鼠4只。按雌雄比例为2∶1进行合笼交配，同时给予含有相应剂量的金雀异黄素的高脂饲料干预3周。其中，低、中、高剂量金雀异黄素组每千克饲料分别加入金雀异黄素600、1800、5400mg，对照组不添加金雀异黄素。实验期间每周称量体重，实验结束后摘取脏器称重，观察雄性大鼠精子密度及母鼠怀孕率。结果 与对照组比较，高剂量金雀异黄素可以降低母鼠及父鼠体重，差异有统计学意义（P＜0.05）。同时高剂量金雀异黄素可以降低雄性大鼠精子密度，降低母鼠受孕率。结论 生育期金雀异黄素干预可以显著降低亲代大鼠的生育能力。

金雀异黄素；生育能力；精子密度；受孕率

金雀异黄素是一种大豆体内天然存在的异黄酮类物质，能与机体内雌激素受体结合而显示出一定的类雌激素样作用［1］。近年来，许多研究表明，金雀异黄素具有抗氧化、抗癌、预防骨质疏松症、预防心血管疾病、改善妇女更年期症状、抗衰老等诸多生理功能［2-5］。近年来，随着大豆深加工产业的发展，出现了大量的大豆浓缩制品以及大豆异黄酮制剂等大豆类提纯产品，人们对金雀异黄素的接触也超过了传统意义上的膳食接触水平。金雀异黄素作为一种环境雌激素，其潜在的毒性作用也越来越受人们重视［6-7］。而现有的研究中，缺乏金雀异黄素暴露对生育期母鼠及雄鼠生殖系统的影响。本实验即通过孕期及哺乳期高剂量金雀异黄素干预母鼠及父鼠，探讨其对亲代大鼠生殖系统的影响，同时观察其对子鼠产量的影响。

1　材料与方法

1.1实验材料及动物

受试样品：大豆异黄酮总含量为98%（西安奥泽生物科技有限公司）。SPF级8周龄SD大鼠48只（北京维通利华实验动物科技有限公司，合格证号：NO.1140070 0005694），雌性32只，雄性16只。体重为180～200 g。

1.2实验方法

1.2.1饲料配制

本实验动物饲料在AIN-93M基础上进行配制，将不同剂量的金雀异黄素均匀混合在饲料中。分为高剂量组、中剂量组、低剂量组以及对照组。低、中、高剂量金雀异黄素组每千克饲料分别加入金雀异黄素600、1800、5400mg，对照组不添加金雀异黄素。饲料配方：成分玉米淀粉350 g/kg、酪蛋白160 g/kg、糊精化玉米淀粉89.5 g/kg、蔗糖100 g/kg、玉米油50 g/kg、猪油150 g/kg、纤维素50 g/kg、混合矿物质35 g/kg、混合维生素10 g/kg、L-胱氨酸3 g/kg、猪胆盐2.5 g/kg。

1.2.2动物分组与处理

8周龄性成熟雌雄大鼠，实验室适应1周后进行随机分组，每组雌鼠8只，雄鼠4只。分别为：高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组。按雌雄比例为2∶1进行合笼交配，各组同时给予含有相应剂量的金雀异黄素的高脂饲料。各组大鼠自由摄食，待子鼠完全出生后处死母鼠及父鼠，检测相关指标。

1.2.3检测指标和方法

1.2.3.1实验期间观察孕鼠的生长和摄食情况，每周称量体重1次。

1.2.3.2实验期间观察父鼠的生长和摄食情况，每周称量体重1次，记录饲养3周后的体重。

1.2.3.3实验结束后取各脏器称重，雌性大鼠取子宫、卵巢称重，雄性大鼠取睾丸、附睾称重。

1.2.3.4检测精子密度，取两侧附睾置于一次性试管中，加入4 mL生理盐水，剪碎组织后于37℃水浴孵育4min。取中间悬浮液10μL置于2mL EP管中，加入990μL生理盐水，稀释100倍后，取100μL铺片后，10×10倍镜下观察。

1.2.3.5受孕率，受孕率=（受孕只数/母鼠例数）×100%。

1.3统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1实验期间不同剂量金雀异黄素对母鼠及父鼠体重的影响

实验期间不同剂量金雀异黄素对母鼠：实验前各组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）；金雀异黄素干预后，各实验组的体重逐渐产生差异；大豆异黄酮干预1周时，高剂量组母鼠体重明显降低，与其他三组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；大豆异黄酮干预3周时，高、中剂量组与对照组相比，体重显著降低（P＜0.05）；同时，随着剂量的增加，雌鼠的体重明显降低，具有明显的剂量-反应关系。实验期间金雀异黄素对父鼠体重的影响：实验前各组大鼠体重差异无统计学意义（P＞0.05）；金雀异黄素干预1周后，高剂量组父鼠体重增长缓慢；到3周末，高剂量和低剂量金雀异黄素干预可以降低父鼠体重，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

2.2不同剂量金雀异黄素干预对母鼠及父鼠脏体比的影响

高剂量金雀异黄素干预可以显著降低母鼠及父鼠脂肪的脏体比（P＜0.05）。同时有增加母体子宫脏体比的趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。其对母鼠其他脏器如脑、肝脏、肾脏、卵巢的脏体比无明显影响（P＞0.05）。同时发现，金雀异黄素对父鼠睾丸及附睾的脏体比无明显影响（P＞0.05）。见表2。

2.3不同剂量金雀异黄素干预对父鼠精子密度及产子量母鼠受孕率的影响

表1　实验期间不同剂量金雀异黄素干预对母鼠及父鼠体重的影响（g，±s）

表1　实验期间不同剂量金雀异黄素干预对母鼠及父鼠体重的影响（g，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别　母鼠只数　0周　1周　2周　3周父鼠只数　0周　1周　2周　3周高剂量组中剂量组低剂量组对照组8888 219.34±10.24 219.05±5.33 219.33±8.47 219.38±8.11 231.81±12.36*245.37±8.1 251.98±6.91 256.17±15.65 243.63±11.75*261.42±19.67 276.93±16.18 279.6±19.36 241.33±10.54*271.97±25.37*289.8±18.74 307.47±36.16 4444 272.45±7.66 267.70±12.64 267.80±6.71 269.00±7.70 294.20±12.85*311.47±28.22 312.13±7.78 328.87±8.83 357.15±46.14 391.40±22.86 389.37±21.37 403.03±14.80 385.00±13.14*422.67±20.13 399.67±18.5*443.33±9.45

高剂量及中剂量金雀异黄素显著降低父鼠精子密度（P＜0.05）。同时，随着金雀异黄素剂量的增加，母鼠受孕率显著减少（P＜0.05）。并且随着剂量的增加，子鼠雌性比例增高（P＜0.05）。见表3。

图1　实验期间不同剂量金雀异黄素干预对母鼠及父鼠体重的影响

3　讨论

金雀异黄素对大鼠的影响目前国内外的结果都不尽相同，但大部分集中在其作为雌激素替代剂对绝经后雌鼠的影响以及对肿瘤的抑制作用。其原因可能与给药剂量、给药时间、接触期限以及给药方式等有关［8-10］。本实验中，采用孕期及怀孕准备期同时给予母鼠及父鼠金雀异黄素，探讨其对母鼠及父鼠体重、脏体比以及生殖能力的影响。本研究发现，高剂量金雀异黄素干预可以降低母鼠及父鼠的体重，同时降低母鼠的脂肪脏体比，并且具有明显的剂量-反应关系。此外，高剂量及中剂量金雀异黄素干预可以显著降低父鼠的精子密度，同时降低雌鼠的受孕率。

目前对于孕期金雀异黄素干预对母鼠体重的影响国内鲜有报道，且大部分都是以大豆异黄酮为干预对象。Kishida等［11］发现通过饮食摄入100～300mg/kg饲料大豆异黄酮可以显著降低7周龄雌鼠的体重，Zhang等［12］发现3600 mg/kg饲料大豆异黄酮显著降低去卵巢雌鼠的体重，其原因是通过抑制摄食量引起的体重降低。这与本研究的结果基本一致。

表2　不同剂量金雀异黄素干预对母鼠及父鼠脏体比的影响（±s）

表2　不同剂量金雀异黄素干预对母鼠及父鼠脏体比的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别　母鼠只数　脂肪　子宫　卵巢父鼠只数　脂肪　睾丸　附睾高剂量组中剂量组低剂量组对照组8888 1.28±0.59*1.60±0.66 2.13±0.89 3.45±1.06 0.23±0.07 0.21±0.05 0.19±0.09 0.17±0.04 0.06±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 4444 1.93±0.41*2.46±0.44 1.96±0.18*2.82±0.44 0.77±0.05 0.73±0.05 0.85±0.06 0.74±0.10 0.32±0.02 0.31±0.08 0.33±0.02 0.33±0.09

表3　不同剂量金雀异黄素干预对父鼠精子密度及产子量母鼠受孕率的影响（±s）

表3　不同剂量金雀异黄素干预对父鼠精子密度及产子量母鼠受孕率的影响（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别雌性子鼠比例（%）父鼠只数　精子密度（×108）母鼠只数　受孕率（%）高剂量组中剂量组低剂量组对照组4444 132.25±26.55*214.67±19.01*222.33±30.07 285.00±49.50 8888 0.00 37.50*50.00*87.50*0.00 61.11*56.25*47.82*

Caceres等［13］发现高剂量大豆异黄酮干预雄鼠，大鼠体重和体重增重量均明显减轻，这与本试验结果一致。说明其影响了雄性大鼠的体重增长，对雄鼠的生长发育产生了负面作用。

本研究中，发现各剂量组金雀异黄素干预对母鼠及父鼠脑、肝脏、肾脏、脾脏等脏器的脏体比均无显著性影响，但显著降低脂肪的脏体比。这与Zhang等［14］的研究一致。其机制可能是与其诱导3T3-L1细胞凋亡有关［15-16］。

大豆异黄酮具有雌激素样作用和抗雌激素样作用，其是否对雄性生殖系统产生副作用仍存在争论［17］。本研究发现高剂量和中剂量的金雀异黄素干预可以显著降低父鼠的精子密度，同时降低母鼠的受孕率。崔洪斌等［18］发现高剂量的大豆异黄酮破坏了雄性大鼠的睾丸结构，使其功能丧失，不能产生成熟精子，因此影响了雄性大鼠的性发育。孙合涛等［19］研究发现孕期暴露大豆异黄酮对雄性子鼠的生殖发育的影响跟大豆异黄酮存在关系，当大豆异黄酮剂量较高时将对雄性子鼠生殖发育产生毒性作用。大豆异黄酮孕期和出生后暴露可干扰子鼠雄性生殖系统的发育，ER-β受体表达变化可能是其机制之一［20］。此外，本研究发现随着剂量的增加，子鼠中雌鼠比例增高，这可能与金雀异黄素的雌激素样作用有关。

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Effect of genistein on fertility of parental rats in the period of mating

SUN Xiaoxi ZHANG YunboGUO JipengNA Xiaolin
Public Health College，Harbin Medical University，Heilongjiang Province，Harbin150081，China

Objective To explore the effect of genistein on body weight and fertility of parental rats in the period of mating.Methods After adaption for 1 week，8 weeks female and male SD rats were randomized to 4 groups:high-dose group，middle-dose group，low-dose group and control group，8 female rats and 4male rats in each group.Female and male rats were mating at ratio of 2∶1.Different dosage of genistein were given at the beginning of mating fed with highfat diet for 3 weeks.The high，meddle and low dose groups were given 5400，1800，600mg genistein into every kg fodder diet respectively.No genistein was added in control group.Body weight was weighted every week.The organ weights of male and female rats were weighted，the sperm density of male rats and pragnancy rate of female rats were observed at the end of experiment.Results Compared with control group，body weight of female rats in high-dose group decreased，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Meanwhile，the sperm density of male rats and pregnancy rate of female rats reduced in high-dose genistein group.Conlusion Genistein can reduce fertility of parental rats in the period of mating.

Genistein；Fertility；Sperm density；Pregnancy rate

R285

A

1673-7210（2016）01（c）-0004-04

2015-10-11本文编辑：苏畅）

国家自然科学基金资助项目（81202190）。

孙晓溪（1987-），女，哈尔滨医科大学环境卫生学专业2013级在读硕士研究生；研究方向：大豆异黄酮的效能。

那晓琳（1964-），女，博士，教授；研究方向：植物雌激素活性。