胆汁淤积性肝病大鼠肝脏及其胆管上皮细胞转化生长因子β的表达

邱冰峰　徐方明　徐汤舟　徐　骐　郗健伟浙江省舟山市舟山医院消化科，浙江舟山　316000

胆汁淤积性肝病大鼠肝脏及其胆管上皮细胞转化生长因子β的表达

邱冰峰徐方明徐汤舟徐骐郗健伟
浙江省舟山市舟山医院消化科，浙江舟山316000

目的 探究胆汁淤积性肝病大鼠肝脏及其胆管上皮细胞转化生长因子β（TGF-β）的表达。方法 将60只6～8周龄健康雌性SPF级SD大鼠分为对照组（d0组）、胆总管结扎术后7 d组（d7组）、胆总管结扎术后14 d组（d14组）及胆总管结扎术后21 d组（d21组），各15只，其中d0组大鼠开腹后轻触胆总管后即关腹。运用Knodell组织学活动指数（HAI）评分来评价各组大鼠肝脏组织学改变，以PCR方法测量各组大鼠肝脏组织和胆管上皮细胞中TGF-βmRNA的表达情况，使用比色法测算细胞培育后4 d内胆管上皮细胞的数量，观察TGF-β1对胆管上皮细胞的增殖作用。结果 肝脏Knodell HAI评分随着术后时间的延长而提高（P＜0.05）；肝脏组织和胆管上皮细胞中TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表达水平随着胆汁淤积时间的延长而显著上调（P＜0.05）；体外研究显示，TGF-β1可抑制胆管上皮细胞增殖。结论 在胆总管结扎导致的胆汁淤积性肝病中，肝脏的受损以及TGF-β的mRNA表达水平也会随着胆汁淤积的时间延长而增加，机体TGF-β1水平与胆汁淤积性肝病的发生发展有着密切关系，随着增生的胆管上皮细胞中TGF-β1表达增高，胆汁淤积性肝脏纤维化发生率也会相应增加。［关键词］胆汁淤积性肝病；胆管上皮细胞；转化生长因子β

据研究试验证实，转化生长因子β（TGF-β）包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种同分异构体，其细胞作用机制与功能可概括为以下几点：①参与机体的免疫调节功能；②参与机体正常细胞增生、分化与凋亡等一系列变化；③对细胞外基质的形成产生一定的刺激作用；④促进诱发组织器官逐渐发生纤维化［1-3］。胆汁淤积性肝病作为临床上一类较为常见的消化系统疾病，具有较多的诱发原因，大量临床研究资料显示，该病在发生发展期间常伴随不同程度的肝内胆管增生，随着增生的不断加重最终可导致胆汁淤积性肝纤维化，从而对肝功能造成不可逆的影响，而此一系列变化都是由TGF-β参与完成的［4-7］。即在胆汁淤积性肝病中，肝内胆汁淤积、肝内胆管上皮细胞增生、TGF-β表达水平上升可以导致肝纤维化，这些病理与生理状态之间存在着紧密的联系［8-10］。由此可见，在胆管上皮细胞中高度表达TGF-β在淤胆性肝病发病机制中起着重要作用。因此，本研究提高制作大鼠肝内胆汁淤积的模型及永生化的小鼠胆管上皮细胞株（immortalized mouse intrahepatic biliary epithelial cell line，mIBEC），探究胆汁淤积性肝病发展不同时期胆管上皮细胞增生与TGF-β表达之间的关系，以及TGF-β对胆管上皮细胞的作用。现总结报道如下：

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

6～8周龄健康雌性SPF级SD大鼠［购于浙江大学基础医学院，动物合格证号：新医动字（新）syxk2014］60只，体重250～300 g，饲养环境温度在18～26℃，相对湿度40%～70%，噪音85 dB以下，氨浓度15.2mg/m3以下，通风换气8～12次/h。所有大鼠采用随机数字表法分为4组，每组15只，每3只一笼，即对照组（d0组）、胆总管结扎术后7 d组（d7组）、胆总管结扎术后14 d组（d14组）及胆总管结扎术后21 d组（d21组），并将d7组、d14组及d21组均记为试验组。

1.2方法

1.2.1模型建立试验组大鼠麻醉后开腹，双重结扎胆总管后，断离胆总管，胆管结扎动物模型即成功建立。对照组大鼠则予开腹后轻触胆总管后即关腹。

1.2.2分离肝间质细胞及胆管上皮细胞分别在术后的第1、2、3周处死大鼠，包括45只试验组大鼠和15只对照组大鼠。将处死大鼠的部分肝脏取出并置于15%福尔马林中浸泡，使用5μm切片对肝脏组织标本进行常规染色，立刻冷冻，提取RNA进行逆转录PCR （RT-PCR）扩增DNA，残余组织用于分离间质细胞，使用PBS清洗液对胶原酶溶液中的肝细胞进行2次冲洗，之后通过3次离心（50 r/min，3 min）将肝细胞除去，取上清液二次离心（350 r/min，3 min）得到肝间质细胞。使用高密度梯度法将胆管上皮细胞从NLPC中分离而出，方法为：在各浓度梯度的Pcoll层放置细胞悬浊液，并在5℃的环境下进行10 min的离心（3000 r/min），胆管上皮细胞量即处于1.055～1.065 g/cm3之间。最终得到的胆管上皮细胞标本，一抗为小鼠抗大鼠CK7，二抗为PE结合的马抗小鼠IgG多抗，试剂均由Wadecam公司提供，在对胆管上皮细胞染色完成后，通过流式细胞学方法检测纯度。

1.2.3肝脏病理组织学及免疫组化检查肝脏切片通过天狼星红染色后观察组织结构，并对所有大鼠Knodell组织学活动指数（HAI）进行评分，根据病理检查结果分别按界面性炎症及桥接坏死的程度按0～10分评定，汇管周围无坏死为0分，轻度片状坏死为1分，中度片状坏死（累及＜30%汇管周围）为2分，中度片状坏死（累及＜50%汇管周围）为3分，明显片状坏死（累及＞50%汇管周围）为4分，中度片状坏死+桥状坏死为5分，明显片状坏死+桥状坏死为6分，多小叶坏死为10分；按小叶内肝细胞变性和坏死的范围及汇管区的炎症状况分别记分为0～4分，肝小叶内无变性和灶性坏死为0分，轻度（嗜酸小体、气球样变性和/或＜1/3结节中散在的肝细胞坏死灶）为1分，中度（累及1/3～2/3肝小叶或结节为3分，明显（累及＞2/3肝小叶或结节）为4分，汇管区无炎症为0分，轻度（＜1/3汇管区出现炎症细胞）为1分，中度（1/3～2/3汇管区炎症细胞增加）为3分，明显（＞2/3汇管区炎症细胞密度增加）为4分；按纤维化的程度分别记1～4分，无肝纤维化为0分，汇管区纤维性扩大为1分，桥状纤维连接（汇管区-汇管区或汇管区-中央静脉连接）为3分，肝硬化为4分［11］。

1.2.4实时定量PCR从大鼠肝脏以及胆管上皮细胞中获取RNA，并将之作为模板通过RT-PCR得到DNA，RNeasy Mini试剂盒由北京方程生物科技有限公司提供。分别自大鼠肝组织及BDEC中提取RNA，以500 ng所提取RNA为模板进行RT-PCR获取cDNA模板。采用QuantiFect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen），TaqMan ABI PRISM 7300实时PCR系统（Applied Biosystems，Foster City，CA）对来自大鼠肝脏组织及不同时间点的BDEC的cDNA模板进行定量扩增。在每次PCR扩增时，取相同量的蒸馏水取代模板并当作阴性对照，使用GAPDH取代模板的当作加样对照［8］。每个样本进行3次检测。

1.2.5TGF-β1对胆管上皮细胞增殖的作用通过6孔培养板培养胆管上皮细胞，并加入TGF-β1和m IBEC培养液（包括DMEM、F12培养液及胎牛血清）一同进行孵育，此外将不添加TGF-β1孵育的细胞作为对照。通过96孔培养板进行细胞增殖培养，培养方法与对照确立方法胆管上皮细胞培养相同，但培养液中需额外加入10 mL/L FBS，使用比色法分别测算细胞培育后4 d内胆管上皮细胞的数量，测定细胞增殖情况。细胞增殖率=（试验后细胞总量-试验前细胞总量）/试验前细胞总量。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据的处理分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用方差分析，组间两两比较则采用LSD-t检验，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠Knodell组织学活动指数评分比较

肝脏Knodell HAI评分随着淤胆时间的延长而增加，d7组、d14组、d21组伴或不伴桥接坏死汇管周围坏死评分、小叶内变性及局灶性坏死评分、汇管区炎症评分、纤维化评分及总分均较d0组明显增高（均P＜0.05），d14组和d21组较d7组伴或不伴桥接坏死汇管周围坏死评分、小叶内变性及局灶性坏死评分、汇管区炎症评分、纤维化评分及HAI总分也明显偏高（均P＜0.05），且d21组HAI各项评分较d14组也明显偏高（均P＜0.05）。见表1。

表1　各组大鼠Knodell组织学活动指数评分比较（分，±s，n=15）

表1　各组大鼠Knodell组织学活动指数评分比较（分，±s，n=15）

注：与d0组比较，*P＜0.05；与d7组比较，#P＜0.05；与d14组比较，△P＜0.05

组别伴或不伴桥接坏死的汇管区周围坏死小叶内变性及局灶性坏死汇管区炎症　纤维化　合计d0组d7组d14组d21组0.2±0.1 2.4±0.5*4.7±1.9*#6.8±1.3*#△0.3±0.1 1.7±0.7*2.6±0.9*#3.1±0.6*#△0.6±0.2 1.4±0.8*2.5±1.3*#3.2±0.7*#△0.2±0.1 1.7±0.9*2.1±1.6*#2.9±0.5*#△0.8±0.3 7.2±2.9*12.9±5.7*#16.0±2.9*#△

2.2各组肝脏组织及胆管上皮细胞中TGF-βmRNA表达水平比较

研究结果显示，肝脏及胆管上皮细胞内表达最多的是TGF-β1mRNA，而较少表达TGF-β2mRNA，而TGF-β3mRNA表达极其微弱。而随着胆汁淤积的发生时间延长，肝脏组织及胆管上皮细胞中的TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表达水平均逐渐增加，d21组、d14组及d7组均显著高于d0组（P＜0.05），且d21组明显高于d14组、d7组（P＜0.05），d14组明显高于d7组（P＜0.05）。见表2～3。

表2　各组肝脏组织中TGF-βm RNA表达水平比较（±s，n=15）

表2　各组肝脏组织中TGF-βm RNA表达水平比较（±s，n=15）

注：与d0组比较，*P＜0.05；与d7组比较，#P＜0.05；与d14组比较，△P＜0.05

组别　TGF-β1mRNA　TGF-β2mRNA　TGF-β3mRNA d0组d7组d14组d21组0.09±0.01 0.18±0.03*0.55±0.02*#0.78±0.03*#△0.01±0.01 0.02±0.01*0.11±0.01*#0.19±0.02*#△0.001±0.001 0.002±0.001*0.010±0.001*#0.017±0.010*#△

表3　各组胆管上皮细胞中TGF-βm RNA表达水平比较（±s，n=15）

表3　各组胆管上皮细胞中TGF-βm RNA表达水平比较（±s，n=15）

注：与d0组比较，*P＜0.05；与d7组比较，#P＜0.05；与d14组比较，△P＜0.05

组别　TGF-β1mRNA　TGF-β2mRNA　TGF-β3mRNA d0组d7组d14组d21组0.50±0.02 0.70±0.03*0.80±0.03*#1.10±0.10*#△0.10±0.01 0.20±0.01*0.70±0.04*#1.00±0.21*#△0.01±0.01 0.10±0.01*0.30±0.02*#1.10±0.15*#△

2.3TGF-β1抑制胆管上皮细胞的增殖情况

TGF-β1作用后1、2、3、4 d，试验组细胞增殖率均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4　TGF-β1抑制胆管上皮细胞的增殖情况（%，±s，n=3）

表4　TGF-β1抑制胆管上皮细胞的增殖情况（%，±s，n=3）

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别　1 d　2 d　3 d　4 d对照组试验组2.6±0.5 1.8±0.4*10.0±1.7 2.0±0.3*6.3±0.8 5.5±0.7*1.3±0.4 1.0±0.2*

3　讨论

近些年来，肝脏疾病的许多基础及临床研究都取得了很大的进步和发展，随着经济生活水平提高以及治疗方案的进步，其疾病的变化也很大［12-14］。在本次研究中所制作的肝脏胆汁淤积大鼠动物模型，其病理特征表现为肝内胆汁淤积、胆管增生、纤维间隔形成等一系列状态。通过Knodell组织学评分系统评估胆汁淤积发生不同时间肝脏组织学的变化，发现肝脏损伤程度可因淤胆时间的不同造成不同影响，绝大多数情况均表现为淤胆时间越长，肝脏损伤程度越重，应引起临床工作者的重视。另外，本研究发现，肝内胆管胆管结扎术后第14天内出现明显增殖，且随着淤胆时间的延长而加重，与以往研究报道基本一致［15-18］。

有研究资料显示，胆管结扎诱导胆汁淤积性肝病多合并出现不同类型的病理改变，其中以肝内胆管增殖作为常见，且随着疾病的进展表现为肝纤维化的加重，出现此类情况的原因是当组织损伤后，参与其中的TGF-β存在着长时间过度表达，这就在一定程度上促进诱导了纤维增生及细胞外基质积聚，从而造成重要器官纤维化，影响其正常的结构与功能，提示TGF-β在肝纤维化发生中起着重要作用［19-20］。本研究发现在肝脏发生纤维化的病变中，胆管上皮细胞中不仅可见到TGF-β蛋白的增加，同时可见TGF-βmRNA含量也显著提升，而此一系列改变与汇管区组织学异常变化及纤维化程度存在着明显的相关性，但其在正常肝脏组织和胆管上皮细胞中的表达较为薄弱，进一步证实了本研究的预期结果。此次试验通过制作大鼠胆汁淤积性肝病模型并分时点检测大鼠肝脏的病理改变，同时运用Knodell组织学评分来评价处理后的肝脏组织学的改变和胆管上皮细胞的TGF-β mRNA表达的具体情况发现，肝脏Knodell组织评分随着术后时间的延长而提高，肝脏组织和胆管上皮细胞中TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的mRNA表达水平随着淤胆时间的延长而显著上调，且大鼠模型显示，TGF-β可抑制胆管上皮细胞增殖，此次研究结果提示了TGF-β表达上升在淤胆性肝病的发生发展中的显著作用，同时分离胆管上皮细胞提示增生的胆管上皮细胞也可凭借TGF-β表达上升在淤胆性肝病的发生发展中起到一定的作用。为以直接的方式证实TGF-β与胆管上皮细胞间的互相影响，本研究同时进行胆管上皮细胞与TGF-β在体外的培养，结果提示TGF-β对胆管上皮细胞的增殖起到了抑制效果。

综上所述，本研究提示TGF-β表达上调在该病发病中发挥了重要的作用，增生的胆管上皮细胞是TGF-β的重要细胞来源，并显示了TGF-β在该病肝纤维化形成中的肯定作用。从本研究结果可以推测出胆汁淤积对胆管结扎后肝纤维化发生的影响重大，但其发病机制是通过感染还是通过胆盐潴留等其他因素合并的刺激在起作用，目前还没有确切的证据证明这个机制，还需要今后进一步探讨研究。

［1］Gonzalez-Moreno O，Lecanda J，Green JE，et al.VEGF elicits-mesenchymal transition（EMT）in prostate intrapithelial neoplasia（PIN）-like cells via an autoctin loop［J］.Exp Cell Res，2010，316（14）：445-446.

［2］白久旭，韩敬明，李旭，等.Netrin-1慢病毒表达载体的构建及延续TGF-β诱导HK-2细胞上皮-间充质转化的初步研究［J］.现代生物医学进展，2012，12（27）：90-91.

［3］梁瑞，张继帅，叶辉，等.Rack1敲低TGF-β诱导的A529细胞的上皮-间充质转化［J］.军事医学，2012，36（1）：29-30.

［4］Kalluri R，WeinbergRA.The basics of epithelial-mesenchy-mal transition［J］.J Clin Invest，2009，119（6）：1420-1428.

［5］王玲.总胆汁酸和前白蛋白在肝脏疾病中的临床价值研究［J］.中国医药科学，2012，2（15）：114.

［6］Han YT，Sun C，Liu CX，et al.Clinical features and outcome of acute hepatitis B in pregnancy［J］.BMC Infect Dis，2014，14（1）：368-369.

［7］孙艳坤，王洋，刘鹏.酒精性肝病的超声诊断［J］.医学信息，2011，24（4）：456-457.

［8］张颖娟，连耀国，郑法雷.VEGF对上皮间充质转化的抑制与Smad信号途径及SnoN表达的变化［J］.北京医学，2012，34（4）：299-300.

［9］Thiery JP，Acloque H，HuangRJ，et al.Epithelial-Mesenchymal transitions in development and disease［J］.Cell，2009，139（5）：871-890.

［10］刘然，刘淑丽，李玉梅.肝病高胆红素对葡萄糖氧化酶法测定血糖的影响［J］.中国医药指南，2010，8（10）：59-60.

［11］李多云，刘黎，周健.血清TBA、CHE及PA联合检测在不同类型肝病诊断中的应用［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2011，20（11）：1043-1044.

［12］Scholten D，Osterreicher CH，Scholten A，et al.Genetic labelingdoes not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice［J］. Gastroenterology，2010，139（3）：987-998.

［13］Czul F，Peyton A，Levy C.Primary biliary cirrhosis：therapeutic advances［J］.Clinics in Liver Disease，2013，17 （2）：229-242.

［14］成志云，彭俊纯，吕颖慧.上皮-间充质转化对肝纤维化作用的研究进展［J］.中国临床药理学与治疗学，2013，18（8）：567-568.

［15］张颖娟，连耀国，李雪梅，等.VEGF165抑制HK2细胞上皮-间充质转化过程NOTCH信号系统的变化［J］.基础医学与临床，2010，30（10）：456-457.

［16］Saeki J，Sekine S，Horie T.LPS-induced dissociation of multidrug resistance-associated prot ein 2（Mrp2）and radixin is associated with Mrp2 selective internalization in rats［J］.Biochem Pharmacol，2011，81（1）：178-184.

［17］Wauters J，Mesotten D，Van Zwam K，et al.The impact of resuscitated fecal peritonitis on the expression of the hepatic bile salt transporters in a porcine model［J］. Shock，2010，34（5）：508-516.

［18］Jaishree V，Badami S.Antioxidant and hepatoprotective effect of swertiamarin from Enicostemma axillare against D-galactosamine induced acute liver damage in rats［J］. J Ethnopharmacol，2010，130（1）：103-106.

［19］李崇辉，叶晟，张爱群，等.胆汁淤积致肝内胆管上皮细胞间质表型转变的病理学分析［J］.军医进修学院学报，2012，33（3）：234-235.

［20］Lee YM，Kim DJ.Primary sclerosing cholangitis［J］.Encyclopedia of Molecular Mechanisms of Disease，1995，332 （14）：924-933.

Expression of transforming growth factorβin the liver and its biliary epithelial cells of rats with cholestatic liver disease

QIU BingfengXU FangmingXU TangzhouXU Qi XI Jianwei
Department of Gastroenterology，Zhoushan Hospital of Zhoushan City，Zhejiang Province，Zhoushan316000，China

Objective To explore the expression of transforming growth factorβ（TGF-β）in the liver and its biliary epithelial cells of rats with cholestatic liver disease.Methods Sixty healthy female SPF SD rats aged 6-8 weeks were divided into control group（d0group），7 days after common bile duct ligation group（d7group），14 days after common bile duct ligation group（d14group）and 21 days after common bile duct ligation group（d21group），with 15 rats in each group，among which，the common bile duct of d0group was touched softly after laparotomy and then abdomen was closed immediately.Knodell histological activity index（HAI）grading was used to evaluate the hepatic histologic changes of rats，the expression of TGF-βmRNA in liver tissue and biliary epithelial cells was detected by PCR，the amount of biliary epithelial cells within 4 d after cell culture was calculated by colorimetric method，the proliferative effect of TGF-β1for biliary epithelial cells was observed.Results The Knodell HAI scores were improved with the extension of postoperative time（P＜0.05）；the levels ofmRNA expression of TGF-β1，TGF-β2and TGF-β3were increased with the extension of cholestasis time（P＜0.05）；the study in vitro showed that TGF-β1could inhibit the proliferation of biliary epithelial cells.Conclusion In the cholestatic liver disease caused by common bile duct ligation，the liver damage and expression of TGF-βmRNA are increased with the extension of cholestasis time，the level of TGF-β1is closely related to the genesis and development of cholestatic liver disease，with the increase of the expression of TGF-β1in hyperplastic biliary epithelial cells，the incidence of cholestatic hepatic fibrosis will be increased relevantly.

Cholestatic liver disease；Biliary epithelial cells；Transforming growth factorβ

R575

A

1673-7210（2016）01（c）-0027-04

2015-10-14本文编辑：张瑜杰）

浙江省卫生厅医药卫生科技计划项目（2010KY B086）；浙江省教育厅高校科研计划项目（Y200908063）。

邱冰峰（1971-），男，博士，副主任医师；研究方向：肝纤维化发病机制及临床诊治。