维生素E对实验性迟发性运动障碍的防治作用及可能机制☆

张冰洁　李艳丽　王志仁　李佳　王月婵　张向阳　杨甫德　周东丰　张秀军　谭云龙



·论著·

维生素E对实验性迟发性运动障碍的防治作用及可能机制☆

张冰洁*李艳丽△王志仁△李佳△王月婵△张向阳△杨甫德△周东丰※张秀军*谭云龙△

目的分析维生素E(vitamin E，Vit E)对迟发性运动障碍(tardive dyskinesia，TD)大鼠模型口周异常不自主运动(vacuous chewing movements，VCM)、血清脑源性营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)水平的影响，探索TD可能的防治机制。方法将32只雄性大鼠随机分为TD组[腹腔注射氟哌啶醇(haloperidol，Hal)2 mg/kg+第5周始灌胃5 mL/kg生理盐水(normal saline，NS)]、Vit E预防组(P-Vit E组，腹腔注射Hal 2 mg/kg+灌胃5 mL/kg VitE溶液)、Vit E治疗组(T-Vit E组，腹腔注射Hal 2 mg/kg+第5周始灌胃5 mL/kg Vit E溶液)、对照组(腹腔注射NS 2 mL/kg+第5周始灌胃5 mL/kg NS)，每组8只，共观察10周，每周第7天进行VCM评分。第10周末，分别采用酶联免疫吸附法、分光光度法检测大鼠血清BDNF、TAC水平。结果第2周末TD组和T-Vit E组VCM评分较干预前VCM评分增加(P<0.05)，并在第5周末达峰值；第6周后T-Vit E组VCM评分逐步下降；第10周末T-Vit E组VCM评分(6.5±3.3)与TD组(27.9±5.8)差异有统计学意义(P<0.01)，与对照组(3.5±1.9)无统计学差异(P>0.05)。P-Vit E组与对照组在10个评估点上VCM评分差异均无统计学意义(P>0.05)。第10周末，TD组血清BDNF[(6.9±1.0)pg/mL]、TAC[(11.9±3.2)U/mL]水平低于对照组[BDNF(8.6±2.5)pg/mL，TAC(18.2±5.5)U/mL]和T-Vit E组[BDNF(8.7±2.0)pg/mL，TAC(18.6±5.9)U/mL](均P<0.01)，与P-Vit E组差异无统计学意义(P>0.05)。结论Vit E可能通过缓解自由基损伤而对TD模型大鼠VCM症状具有防治作用。

迟发性运动障碍物质诱发性维生素E脑源性营养因子抗氧化

迟发性运动障碍(tradive dyskinesia，TD)是长期服用抗精神病药物所致的运动异常，具有明显致残性和发生率高等特点[1]。有学者推测，随着新型抗精神病药的推广，TD的发生率将下降[2]。而研究证实，第2代抗精神病药物TD发生率为3.9%，较第1代抗精神病药物5.5%略有下降[3]。TD的发病机制尚未阐明，目前主要有多巴胺受体超敏假说和神经元变性假说，但均难以解释患者的全部临床症状[1]。临床上目前多采用氯硝西泮、丁苯那嗪、金刚烷胺、普萘洛尔等药物治疗TD，但是效果并不理想。最近有学者提出，神经元保护因素和损伤因素失衡可能在疾病发生发展过程中作用关键[4]。维生素E(Vit E)为脂溶性自由基俘获剂，可插入质膜，阻断脂质过氧化级链反应，使自由基脂质过氧化物生成减少，提高机体抗氧化酶活性，缓解自由基损伤，由此推测，Vit E可能对TD有预防和治疗作用[5]。本研究以Vit E为治疗药物，探索其对TD模型大鼠防治作用及可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(维通利华生物公司提供)共32只，体重220～300 g。实验前适应性饲养1周。大鼠随机分为TD组、Vit E预防(P-Vit E)组、Vit E治疗(T-Vit E)组、对照组，每组8只。所有大鼠饲养条件相同，自由进食、进水，自然节律光照，12 h光照，12 h黑暗。

1.2TD大鼠模型制备TD组、P-Vit E组和T-Vit E组大鼠采用连续10周每日腹腔注射氟哌啶醇(haloperidol，Hal)2 mg/kg的方法制备TD模型[6]；对照组每日腹腔注射生理盐水(normal saline，NS)2 mL/kg。TD组第5周始每日灌胃5 mL/kg NS，P-Vit E组第1周始每日灌胃5 mL/kg Vit E溶液(即126 IU/kg/d)，T-Vit E组第5周始每日灌胃5 mL/kg Vit E溶液，对照组第5周始每日灌胃5 mL/kg NS。

1.3口周异常不自主运动(vacuous chewing movements，VCM)评分每周第7天对所有大鼠进行VCM行为学评估，包括口部空嚼运动、下颚爆发性震颤、突发性伸舌异常[6]。在20 cm×30 cm×30 cm镜箱中进行评分，适应1 min后，记录大鼠在5 min内发生口部空嚼运动(计1分/次)和下颚爆发性颤抖、突发性伸舌(分别计2分/次)次数，VCM评分为累计总分[7]。评分采用盲法，由同一人进行。

1.4血清脑源性营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)水平检测所有大鼠于第10周末腹腔注射10%水合氯醛(6 mL/kg)，麻醉后腹腔静脉取血2 mL，分离血清待测。BDNF浓度采用酶联免疫吸附法检测，操作方法严格按试剂盒(美国Progma公司提供)说明书进行；TAC水平采用分光光度法检测(仪器由南京建成生物工程研究所提供)。所有样本由同一人进行双点检测，结果取平均值。批内差异<5%，批间差异<7%。

1.5统计学方法运用SPSS 19.0进行统计分析。VCM评分、BDNF和TAC水平符合正态分布，各组每周VCM评分比较采用重复测量方差分析，比较第10周末各组血清BDNF和TAC水平采用方差分析，多重比较采用LSD法。BDNF与TAC水平的相关性采用Pearson相关分析。检验水准α为0.05，双侧检验。

2　结果

2.1各组大鼠VCM评分4组大鼠分组主效应有统计学意义(F=46.85，P<0.01)，分组与时间交互作用有统计学意义(F=9.22，P<0.01)。进一步分析显示，大鼠腹腔注射Hal 2周后，对照组VCM评分均低于TD组、T-Vit E组(均P<0.05)，与P-Vit E组差异无统计学意义(P<0.05)；TD组和T-Vit E组VCM评分逐步升高，至第5周末达峰值，第1周至第5周TD组和T-Vit E组间VCM评分差异无统计学意义(P>0.05)，自6周末(Vit E干预1周)始，T-Vit E组VCM评分逐渐下降，直至第10周末，第8周至第10周T-Vit E组评分低于TD组(P<0.05)。见表1与图1。

表1　4组大鼠每周VCM评分

1)与对照组比较，经LSD-t检验，P<0.05；2)与T-Vit E组比较，经LSD-t检验，P<0.05；3)与P-Vit E组比较，经LSD-t检验，P<0.05

图1　4组大鼠每周VCM评分

2.2各组大鼠血清BDNF和TAC水平实验第10周末，4组大鼠血清BDNF水平(F=4.39，P=0.02)和TAC水平(F=14.98，P<0.01)均有统计学差异。两两比较示，TD组血清BDNF、TAC水平低于T-Vit E组和对照组(P<0.05)；P-Vit E组血清BDNF水平与其余3组无统计学差异(P>0.05)，TAC水平低于T-Vit E组和对照组(P<0.01)，与TD组无统计学差异(P>0.05)；T-Vit E组与对照组血清BDNF和TAC水平无统计学差异(P>0.05)。

表2　第10周4组大鼠血清BDNF和TAC水平

1)与对照组比较，经LSD-t检验，P<0.05；2)与T-Vit E组比较，经LSD-t检验，P<0.05

2.3各组大鼠血清BDNF与TAC相关性相关分析显示，对照组大鼠血清BDNF与TAC水平相关(r=0.69，P=0.02)，而TD组(r=0.07，P=0.86)、P-Vit E组(r=0.24，P=0.51)、T-Vit E组(r=0.14，P=0.75)BDNF与TAC水平未发现有统计学相关。

3　讨论

TD是由抗精神病药物所诱发的运动系统副作用，严重影响精神病患者的生活质量和康复。对于TD目前尚无有效干预措施，因而寻找有效的防治方法对提高患者抗精神病治疗的依从性和社会功能恢复至关重要。动物研究提示，TD发生可能与抗精神病药所致的运动环路神经元持久改变有关[3]；而脑内儿茶酚胺神经递质代谢产生的自由基对神经细胞具有毒性作用[8]，该毒性作用以及保护因素的缺乏在TD发生过程中作用关键。Vit E可通过直接和间接(提高抗氧化酶活性)途径清除体内氧化活性物质和自由基，因而Vit E可能对TD有一定的防治作用。

本研究结果显示，TD组和T-Vit E组腹腔注射氟哌啶醇1周后，大鼠VCM评分逐渐升高。自第6周始，T-Vit E组使用Vit E溶液灌胃，治疗1周后，T-Vit E组VCM评分有所下降，至实验第10周VCM评分降至最低，与对照组无差异。P-Vit E组从第1周使用Vit E溶液灌胃，10次VCM评分均维持较低水平，与对照组无统计学差异。研究显示，Vit E缺乏的老龄大鼠可出现海马CA1区神经元轴突变性[9]；采用Vit E治疗可延缓白质变性患者疾病的进程[10]。由此推测，Vit E可能通过保护神经元对TD产生防治作用。

机体存在抗氧化系统，可有效清除自由基[11]。本研究采用TAC全面反映机体清除自由基、缓解氧化应激的能力，结果提示，TD组大鼠血清TAC水平低于对照组，自由基清除和抗氧化能力下降。临床研究也有类似发现，TD患者血浆抗氧化酶活性下降，过氧化物浓度增加[12]。而Vit E治疗可缓解这一改变，本研究中经过5周的干预，T-Vit E组血清TAC水平与对照组比较无统计学差异。有研究显示，Vit E可通过提高抗氧化酶的活性，改善机体由于氧化应激所引起的突触传递[13]、细胞损伤从而导致大鼠学习、记忆功能下降[14]的情况，与ECKERT等[15]研究结果类似，本研究中P-Vit E组TAC水平也较低，与TD组无差异。这可能是由于Vit E本身具有自由基俘获功能，增加生成的自由基被及时清除，并没有出现自由基在体内积累情况，从而降低了自由基增加所带来的抗氧化酶活性代偿性改变。体外细胞培养实验也表明，Vit E可通过提高抗氧化酶的活性保护神经细胞，将神经细胞暴露于去极化剂中培养，突触小体通过改变胞内Na+、K+、Ca2+浓度影响膜电位和细胞功能，Vit E可通过提高抗氧化酶的活性而预防或逆转这一改变[16]。

TD的发生不仅与自由基代谢异常有关，神经元保护因素下降也起重要作用[17]。本研究提示，TD组血清BDNF水平低于对照组，而Vit E治疗可增加大鼠血清BDNF水平。Vit E升高TD模型大鼠血清BDNF水平可能是通过调节抗氧化酶活性、缓解氧化应激的间接效应实现，与ALZOUBI等[18]的结果类似。研究发现，机体抗氧化酶的活性与BDNF存在关联，两者的交互作用可能在神经精神疾病发生过程中扮演重要角色[19]。因此，TD模型大鼠血清BDNF水平升高可能是通过调节抗氧化酶活性、缓解氧化应激的间接效应实现。P-Vit E组BDNF水平与TD组无差别，可能与体内生成的自由基被及时清除，Vit E对神经元的预防保护未出现代偿有关[20]。

本研究发现，对照组TAC与BDNF相关。有研究表明，BDNF与机体的抗氧化系统存在相互作用，BDNF可刺激细胞增加抗氧化酶蛋白(过氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等)的表达，通过提高这些酶的活性以缓解自由基对细胞(或神经元)的损伤[21]。其机制可能为，BDNF暴露可促进蛋白激酶1(protein kinase-1，PKG-1)和核转录因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)亚单位p65/p50形成复合物，并与sestrin-2蛋白结合，增加抗氧化酶的表达，达到抗氧化和清除自由基的作用[21]。其他3组TAC与BDNF未显示类似的相关关系，可能与经过一系列的药物干预，两者平衡体系被破坏有关。

本研究提示，Vit E对TD模型大鼠的异常不自主运动症状有良好的预防和治疗作用。但由于本实验建立模型和治疗的时间相对较短，样本量小，要明确神经元的保护因素和自由基代谢异常在TD发生发展过程中的作用，尚有待进一步探索。有关Vit E否合适在临床推广应用，还需要开展系统的临床研究加以控索。

[1]TREVIZOL F, BENVEGNU DM, BARCELOS RC, et al. Comparative study between two animal models of extrapyramidal movement disorders: prevention and reversion by pecan nut shell aqueous extract [J]. Behav Brain Res, 2011, 221(1): 13-18.

[2]CAROFF SN, MANN SC, CAMPBELL EC, et al. Movement disorders associated with atypical antipsychotic drugs [J]. J Clin Psychiatry, 2002, 63(Suppl 4): 12-19.

[3]CORRELL CU, SCHENK EM. Tardive dyskinesia and new antipsychotics [J]. Curr Opin Psychiatry, 2008, 21(2): 151-156.

[4]王宁, 谭云龙, 杨甫德, 等. 精神分裂症伴发迟发性运动障碍的血清S100B蛋白浓度研究[J]. 中国神经精神疾病杂志, 2011, 37(9): 550-553.

[5] 王学义, 李文通, 于江, 等. 维生素E治疗迟发性运动障碍的初步观察[J]. 中国神经精神疾病杂志, 1993, 19(2): 114.

[6]HALEEM DJ, SAMAD N, HALEEM MA. Reversal of haloperidol-induced tardive vacuous chewing movements and supersensitive somatodendritic serotonergic response by buspirone in rats [J]. Pharmacol Biochem Behav, 2007, 87(1): 115-121.

[7]KANEDA H, SHIRAKAWA O, DALE J, et al. Co-administration of progabide inhibits haloperidol-induced oral dyskinesias in rats [J]. Eur J Pharmacol, 1992, 212(1): 43-49.

[8]AKDERE H, TASTEKIN E, MERICLILER M, et al. The protective effects of Ginkgo biloba EGb761 extract against renal ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(19): 2936-2941.

[9]FUKUI K, MASUDA A, HOSONO A, et al. Changes in microtubule-related proteins and autophagy in long-term vitamin E-deficient mice [J]. Free Radic Res, 2014, 48(6): 649-658.

[10]GOPALAN Y, SHUAIB IL, MAGOSSO E, et al. Clinical investigation of the protective effects of palm vitamin E tocotrienols on brain white matter [J]. Stroke, 2014, 45(5): 1422-1428.

[11]LA FATA G, WEBER P, MOHAJERI MH. Effects of vitamin E on cognitive performance during ageing and in Alzheimer’s disease [J]. Nutrients, 2014, 6(12): 5453-5472.

[12]谭云龙, 周东丰, 张向阳, 等. 迟发性运动障碍患者血浆超氧化物歧化酶、过氧化化氢酶、谷胱苷肽过氧化物酶活性及丙二醛水平的改变[J]. 中华精神科杂志, 2005, 38(3): 166-168.

[13]KANEAI N, ARAI M, TAKATSU H, et al. Vitamin E inhibits oxidative stress-induced denaturation of nerve terminal proteins involved in neurotransmission [J]. J Alzheimers Dis, 2012, 28(1): 183-189.

[14]ZHANG C, REN C, CHEN H, et al. The analog of Ginkgo biloba extract 761 is a protective factor of cognitive impairment induced by chronic fluorosis [J]. Biol Trace Elem Res, 2013, 153(1-3): 229-236.

[15]ECKERT A, SCHINDOWSKI K, LEUTNER S, et al. Alzheimer’s disease-like alterations in peripheral cells from presenilin-1 transgenic mice [J]. Neurobiol Dis, 2001, 8(2): 331-342.

[16]THAKURTA IG, BANERJEE P, BAGH MB, et al. Combination of N-acetylcysteine, alpha-lipoic acid and alpha-tocopherol substantially prevents the brain synaptosomal alterations and memory and learning deficits of aged rats [J]. Exp Gerontol, 2014, 50: 19-25.

[17]CARDOSO HD, DOS SJEF, DE SANTANA DF, et al. Omega-3 deficiency and neurodegeneration in the substantia nigra: involvement of increased nitric oxide production and reduced BDNF expression [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1840(6): 1902-1912.

[18]ALZOUBI KH, KHABOUR OF, SALAH HA, et al. Vitamin E prevents high-fat high-carbohydrates diet-induced memory impairment: the role of oxidative stress [J]. Physiol Behav, 2013, 119: 72-78.

[19]ZHANG XY, CHEN DC, TAN YL, et al. The interplay between BDNF and oxidative stress in chronic schizophrenia [J]. Psychoneuroendocrinology, 2015, 51: 201-208.

[20]AKDERE H, TASTEKIN E, MERICLILER M, et al. The protective effects of Ginkgo biloba EGb761 extract against renal ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2014, 18(19): 2936-2941.

[21]WU CL, CHEN SD, YIN JH, et al. Nuclear Factor-kappaB-Dependent Sestrin2 Induction Mediates the Antioxidant Effects of BDNF Against Mitochondrial Inhibition in Rat Cortical Neurons [J]. Mol Neurobiol, 2015[2015-06-26]. http://dx.doi.org/10.1007/s12035-015-9357-1.

(责任编辑：肖雅妮)

The efficacy of treatment and prevention of vitamin E on haloperidol-induced tardive dyskinesia and its possible mechanisms in rats.

ZHANG Bingjie, LI Yanli, WANG Zhiren, LI Jia, WANG Yuechan, ZHANG Xiangyang, YANG Fude, ZHOU Dongfeng, ZHANG Xiujun, TAN Yunlong.

Psychology College of North China University of science and technology, Tangshan, Hebei, 0630002. Tel: 0315-3726425.

ObjectiveTo investigate the efficacy of treatment and prevention of VitE on vacuous chewing movements (VCMs) of haloperidol-induced tardive dyskinesia (TD) rats and serum levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and total antioxidant capacity (TAC), and to explore the possible mechanisms.MethodsThirty-two male Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into TD, P-Vit E, T-Vit E and control group (n=8), receiving to-week treatment with Haloperidol (Hal)+NS, Hal+Vit E (medicated at the baseline), Hal+VitE (medicated at the fifth week) or normal saline (NS), respectively. VCM was evaluated at each week. ELISA and spectrophotometer were used to detect the serum levels of BDNF and TAC, respectively.ResultsThe VCM score of both TD group and T-Vit E group increased at the 2ndweekend, reached the peak at the 5thweekend. VCM score of T-Vit E group declined gradually at the 6th weekend and was significantly lower than that in the TD group [(6.5±3.3) vs. (27.9±5.8),P<0.001] but was not significantly different from the control group (3.5±1.9) (P>0.05) at the 10thweekend. There was no significant difference in VCM score between P-Vit E group and control group for ten weeks(P>0.05). At the 10thweekend, serum BDNF [(6.9±1.0) pg/mL] and TAC [(11.9±3.2) U/mL] levels of TD group were significantly lower than those of the controls [BDNF (8.6±2.5) pg/mL, TAC (18.2±5.5) U/mL] and T-Vit E group [BDNF (8.7±2.0) pg/mL, (18.6±5.9) U/mL] (P<0.01). However, there was no significant difference in the BDNF and TAC levels between TD and P-Vit E groups (P>0.05).ConclusionsVit E may relieve and prevent VCM in TD model rats though alleviation of free radical damage.

Tardive dyskinesiasubstance-inducedVitamin EBrain-derived neurotrophic factorAntioxidant capacity

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.06.006

☆国家自然科学基金(编号：81071086；81461130016)

*华北理工大学(唐山063000)

△北京回龙观医院

※北京大学精神卫生研究所，卫生部精神卫生重点实验室

E-mail：zhangxiujun66@163.com)

R749.3

A

2015-10-21)