不同氧浓度对体外受精—胚胎移植妊娠结局的影响

罗丹　高颖　丁晓芳　舒德峰　朱燕　李璐璐　钟少红

[摘要]目的：探讨体外培养时不同氧浓度对体外受精一胚胎移植（in vitro fertilization-embryotransfer，IVF-ET）中胚胎发育潜能及妊娠结局的影响。方法：将471例于2013年在本生殖中心行IVF-ET的患者，根据其体外培养的氧浓度将其随机分为5%低氧浓度组（n=247）和20%高氧浓度组（n=224）。比较两组间卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、临床妊娠率、着床率及活产率。结果：两组间患者的卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、临床妊娠率、着床率均无统计学差异（P>0.05）。但低氧浓度组的活产率显著高于高氧浓度组（48.2%vs.38.4%，P<0.05）。结论：低氧浓度胚胎培养能够改善IVF的妊娠结局。

[关键词]氧浓度；体外受精；胚胎移植；活产率

[中图分类号]R697 [文献标志码]A

在生理条件下，胚胎置身于2%～8%的氧浓度中，但目前有不少辅助生殖技术实验室是在大气氧浓度（约20%）下培养胚胎。已经有很多哺乳动物实验证明，在这种超生理浓度的氧分压下培养胚胎会影响胚胎的代谢、发育及相关基因表达。而关于高氧浓度培养对人类胚胎的影响方面的研究仍相当有限，并且结果尚不一致。有些研究显示低氧浓度培养可以提高IVF/ICSI的着床率、妊娠率和活产率，但另一些研究则显示降低氧浓度未能显著提高胚胎的质量、着床率和妊娠率。本研究旨在探讨低氧浓度下培养人类胚胎能否改善IVF的妊娠结局。

1 资料和方法

1.1 研究对象

本研究为前瞻性随机对照研究。选择于2013年1月至12月在本中心行标准长方案IVF-ET治疗的患者进行研究。纳入标准：（1）年龄在20～35岁之间；（2）首次行IVF-ET助孕的患者：（3）基础卵泡刺激素（FSH）<10 IU/L，基础黄体生成激素（LH）<10 IU/L；（3）患者的体质量指数（BMI）≤23 kg/m²。排除标准：（1）有习惯性流产病史；（2）纵隔子宫、双子宫等子宫畸形；（3）子宫肌瘤、子宫腺肌病等影响宫腔形态的疾病。该研究经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。符合条件的患者共471例，根据进入治疗周期的顺序按随机数字法分为5%低氧浓度组（研究组）和20%高氧浓度组（对照组）。低氧浓度组置于5%的氧气浓度下，高氧浓度组置于20%的氧气浓度下。

1.2 研究方法

1.2.1 促排卵方案 两组对象均采用标准长方案进行促排卵，于前一月经周期的黄体中期开始注射GnRHa进行降调节。月经来潮后根据降调水平开始以Gn启动，利用B超和血清激素水平检测卵泡发育。当达到取卵标准时，于当晚8时左右注射HCG 10000 IU促进卵泡的最后成熟，34～36 h后在超声引导下经阴道取卵。

1.2.2 胚胎培养及形态学评分 卵子和胚胎培养均采用瑞士Vitrolife公司的G系列序贯培养液。取卵后将研究组的卵母细胞置于氧气浓度为5%的三气培养箱（5%CO₂+5%O₂+90%N₂，Benchtop培养箱，COOK公司，澳大利亚）中培养：而对照组则置于氧气浓度为20%的单气培养箱（5%CO₂+空气，Gal-axy S+培养箱，RS Biotech公司，英国，三气培养箱生产批号AC855498，单气培养箱生产批号16895）。取卵后3～4h行常规体外授精，受精18-20h后，观察原核判断受精情况。于受精后第2d、第3d对胚胎进行形态学评分。Ⅰ级：胚胎卵裂球均匀规则，胞质均质透明，透明带完整，胚胎无或仅有极少（<5%）碎片：Ⅱ级：卵裂球形态轻度不均匀，胞浆折光性有轻微变化，碎片<20%，透明带完整；Ⅲ级：胚胎内碎片<50%，其余卵裂球形态同Ⅱ级；Ⅳ级：胚胎内碎片>50%，碎片外卵裂球具有活细胞特征，胞浆折光性有较大改变，胞浆变黑颗粒不均匀。Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎。

1.2.3 胚胎移植及妊娠结局判断 于受精后第3d根据患者年龄、周期及胚胎情况选择形态评分最佳的1～3枚胚胎进行移植，剩余胚胎行囊胚培养至第7d，将优质囊胚进行冷冻保存，囊胚培养均在氧气浓度为5%的三气培养箱中进行。移植后14d查血HCG确定生化妊娠，30d行B超检查，见孕囊及胎儿心管搏动确定临床妊娠。

1.2.4 观察指标 记录患者的一般情况（年龄、BMI、不孕年限、获卵数），实验室指标（卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率）及妊娠结局（临床妊娠率、着床率及活产率）。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.O软件包进行统计分析，两样本均数之间的比较采用t检验，率的比较采用x²检验，P<0.05说明组间差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较

2013年1月至12月被纳入研究组患者共247例，对照组224例。两组患者之间的平均年龄、BMI、不孕年限、平均获卵数均无显著性差异（P>0.05）。见表1。

2.2 实验室指标及妊娠结局比较

两组患者的卵子成熟率、受精率、卵裂率、正常受精率、多PN率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、临床妊娠率、着床率均无显著性差异（P>0.05），但研究组的活产率显著高于对照组（P<0.05）。见表2。

3 讨论

在大气氧浓度下进行胚胎培养能够增加活性氧（reactiveoxygen species，ROS）的产生，而高浓度的ROS能够损伤细胞器及细胞膜，对DNA产生直接或间接的破坏，并且能改变基因表达。通过降低氧浓度是否可以减少这些负面效应，临床研究的结果尚不一致。多数研究认为低氧培养环境有利于改善妊娠结局，但也有研究未发现临床结局有改善。

Kea等的研究得出低氧浓度的培养环境对IVF/ICS[周期的受精率、囊胚形成率和妊娠率均无显著性改善。Dumoulin等“也没有发现低氧对于胚胎培养的优势。Bahceci等发现5%氧环境下第3d的胚胎评分显著高于20%氧浓度，但临床结局无显著性差异。本研究的结果虽然在胚胎的受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚形成率、可利用胚胎率、临床妊娠率及着床率等方面没有显示出差异，但低氧培养组的活产率显著高于高氧浓度组。活产率的提高从临床最终结局方面说明了低氧浓度培养的优势。

Ciray等将进行ICSI治疗的同一个患者卵子随机放入5%氧浓度和20%氧浓度的培养箱中，观察到5%氧浓度下第3d的优质胚胎数和第6d的囊胚形成数显著增多，认为生理氧浓度更适合胚胎的整个体外培养过程。本研究并没有观察到这种差异，分析其原因，可能与以下几点有关：（1）本研究选择的病例为常规IVF患者，其卵冠丘复合物周围的颗粒细胞对卵子提供了一定的保护作用，可以中和一部分ROS带来的损伤，所以在胚胎培养的早期我们可能不易观察到这种差异；（2）培养液成分的不同，由于我们使用的是商业化试剂，不同的试剂种类其中所添加的抗氧化剂成分和量也许存在差异：（3）胚胎评价系统的差异，目前胚胎评价系统主要是根据卵裂球的数目、均匀程度以及无核碎片的比例等参数来判断，跟观察者的主观判断有很大关系：（4）样本量的差异。

目前这些研究主要关注于胚胎的形态学和着床情况，将来的研究应该更加关注于一些其他的反应胚胎潜能的指标，比如基因表达的改变或者表观遗传学的差异。Rinaudo等对鼠胚的研究显示，5%氧浓度下培养的鼠胚其基因表达图谱更接近于体内发育的胚胎。Katz-Jaffe等的研究则显示低氧环境下胚胎的蛋白组学分析更接近于体内发育的胚胎。还有一项研究显示，在培养液中加入血清可以影响基因印记的表达，血清暴露的小鼠在20月龄时其心脏和肝脏重量高于对照组，并且显示出行为异常和记忆力缺陷。

综上所述，本研究显示低氧浓度培养可以提高IVF-ET周期的活产率，但仍需进行大样本的随机对照研究来发现其差异，并且今后的研究应该进一步从分子水平来阐明不同氧浓度对胚胎发育的影响机制，从而改善IVF结局。

（收稿日期：2015-10-10）endprint